前言:　　前列腺癌是男性中最常见的上皮恶性肿瘤之一，患者早期无明显特异性临床症状，因此，确诊时多数患者已发展至中晚期，患者错过癌症最佳治疗时期，导致前列腺癌患者预后效果差、死亡率高。遗传因素、过多性生活、不良饮食习惯等因素增加了前列腺癌发生的风险，使得前列腺癌具有较高的发病率。因此，前列腺癌的治疗成为了广大科研工作者的研究重点。　　手术、化疗和放疗是癌症治疗的常见治疗方式。手术治疗作为癌症治疗的首选能够完全移除肿瘤，然而对晚期肿瘤和转移性肿瘤的治疗效果有限，同时对患者造成永久性创伤。化疗作为全身治疗手段能够杀伤多种肿瘤细胞且取得了良好的癌症治疗效果。然而由于化疗药物缺乏特异性，常引起患者出现免疫功能低下、肝肾损伤、骨髓抑制等不良反应，限制了化疗药物癌症治疗的应用。放疗在肿瘤治疗中的地位和作用受到了广泛的关注，然而放疗受肿瘤病理分级、细胞分化程度、增殖速度、细胞含氧量等多种因素影响，降低了放疗应用范围。内分泌治疗是中晚期前列腺癌治疗的首选治疗方案，但内分泌治疗难以完全杀灭肿瘤细胞，并且导致雄激素非依赖性前列腺癌的发生以及性欲减退、肌力降低等多种副作用。因此，寻找新型方案成为了前列腺癌治疗的关键。　　肿瘤免疫治疗是一种利用免疫系统杀伤肿瘤细胞的新型癌症治疗方式，具有副作用小、特异性强等优点。其通过提高肿瘤细胞免疫原性以及免疫效应细胞的肿瘤杀伤敏感性达到有效杀伤肿瘤细胞的目的。树突细胞(Dendritic cell，DC)作为专职抗原呈递细胞，能够有效摄取和加工处理抗原，然后通过主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)-Ⅰ呈递抗原并激活初始T细胞，实现启动、调控和维持免疫应答的作用。细胞毒T淋巴细胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)能够根据呈递的抗原而特异性识别肿瘤细胞，能够通过Fas/FasL途径促进促凋亡相关蛋白分泌，同时释放穿孔素与颗粒酶达到溶解细胞的目的。因此，选择合适抗原决定CTL的肿瘤识别能力和抗肿瘤功能。　　前列腺干细胞抗原(Prostate stem cell anti gen，PSCA)主要在前列腺上皮细胞表面表达，其通过葡萄糖磷脂酰肌醇共价锚定于细胞膜表面。PSCA在恶性肿瘤组织如前列腺癌、胰腺癌等肿瘤中高表达，其表达程度与肿瘤组织病理分级、分化程度、播散程度等呈正相关，并且在正常人类组织组织如前列腺基底细胞表面中呈现低表达。由于PSCA是一种特异性膜表达抗原，而不是分泌型，与PSA、PAP等分泌型抗原相比具有独一无二的优势在诱导免疫耐受方面，所以PSCA不仅是前列腺癌等相关肿瘤诊断及预后判断的重要生物学指标，同时也是肿瘤免疫治疗的潜在的重要靶点。由于其特有的性质和明显的优势使PSCA成为了肿瘤免疫治疗的理想靶点。　　来自自身细胞突变的前列腺癌细胞具有较弱的抗原性，同时其能够分泌多种细胞因子而抑制DC的抗原摄取和呈递能力，导致肿瘤患者免疫功能低下。因此，提高DC的抗原摄取和呈递能力对提高机体肿瘤细胞杀伤能力具有重要意义。重组腺病毒是重要的分子生物学工具，能将外源基因转至细胞内且能够促进蛋白分子持续表达而不损伤细胞，同时具有安全性好、转染效率高、操作简单等优点。因此利用重组腺病毒能够引起DC持续性表达PSCA，提高了DC抗原加工处理和呈递能力。　　本研究拟构建PSCA重组腺病毒表达载体，通过转染人DC而提高其抗原呈递能力以及激活初始T淋巴细胞能力，从而获得抗原特异性CD8+ CTL。同时检测了PSCA特异性CD8+CTL的前列腺癌细胞细胞杀伤效果，并进一步进行了动物模型实验。　　材料与方法:　　一、实验材料　　1、细胞株:　　PC-3（人前列腺癌细胞）、LNcap（人前列腺癌细胞）和RWPE-1（人前列腺上皮细胞）购于ATCC。细胞培养及消化传代按照ATCC细胞培养说明进行。　　2、实验动物　　4-5周龄Balb/c-nu/nu雄性裸鼠购买于中国医科大学实验动物中心，裸鼠饲养及相关实验严格按照动物福利法要求进行。　　3、组织标本　　外周血采集自成年健康男性志愿者。　　二、主要研究方法　　1、PSCA重组腺病毒构建以及鉴定:扩增PSCA基因并通过Adxsi系统构建复制缺陷型重组腺病毒载体pAdxsi-PSCA，然后大量制备该载体。转染HEK293细胞后进行PSCA重组腺病毒包装以及扩增。通过CsCl密度梯度离心进行病毒纯化，并采用TCID50法进行病毒滴度测定。通过PCR法对重组腺病毒PSCA基因进行鉴定。　　2、采集健康男性志愿者外周血，收集单核细胞源性树突细胞，体外诱导培养后进行重组腺病毒转染:通过密度梯度离心法收集加入淋巴细胞分离液的外周血中的单核细胞，贴壁细胞用于DC培养，非贴壁细胞用于T细胞培养。利用PSCA-GFP重组腺病毒进行DC转染，同时通过流式细胞仪、共聚焦显微镜确定最佳MOI值和最佳感染时间。同时通过Western blot鉴定AdPSCA转染DC的PSCA蛋白表达情况。　　3、通过倒置相差显微镜观察AdPSCA转染对DC形态影响;利用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测重组腺病毒转染DC后细胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达情况，同时利用ELISA法检测重组腺病毒转染对DC表达白介素(IL)-1O和IL-12表达影响;通过迁移实验检测重组腺病毒转染对DC迁移能力的影响。　　4、AdPSCA-DC与初始T淋巴细胞共培养，利用CCK-8法确定AdPSCA-DC对自体及异体T淋巴细胞增殖能力的影响;经过3轮刺激后，并利用免疫磁珠分选CD8+CTL，确定AdPSCA-DC诱导CD8+CTL产生情况。　　5、通过Western blot确定PC-3、LNcap和RWPE-1中PSCA表达情况;利用流式细胞仪测定AdPSCA-DC-CD8+CTL对PC-3细胞最佳杀伤比例;利用流式细胞仪测定DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL分别对PC-3、LNcap和RWPE-1杀伤效果。　　6、通过酶联免疫斑点实验测定在PC-3、LNcap和RWPE-1存在条件下，DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL表达干扰素(IFN)-γ表达情况。　　7、检测DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制肿瘤形成情况。　　8、Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部皮下注射PC-3细胞，构建前列腺癌荷瘤裸鼠模型。　　9、检测DC-CD8+CTL、Adnull-DC-CD8+CTL和AdPSCA-DC-CD8+CTL对荷瘤裸鼠的肿瘤杀伤情况、体重影响以及存活时间影响。　　10、利用苏木精-伊红(HE)染色检测各组CD8+CTL处理后肿瘤组织病理学改变情况以及利用免疫组织化学染色检测各组CD8+CTL处理后肿瘤组织中VEGF、Bax和Bcl-2表达情况。　　11、统计学分析:上述实验重复至少3次。采用SPSS17.0对文中数据进行统计和分析，结果采用均数±标准差（(x)±s）形式表示，数据间比较采用SNK-q检验， P＜0.05代表比较有显著差异。　　结果:　　1、通过酶切、琼脂糖电泳、测序和PCR鉴定，证实成功构建PSCA重组腺病毒载体，病毒滴度达到2.5×1011pfu/ ml;通过流式细胞仪和共聚焦显微镜确定最佳转染MOI为200，最佳感染时间为48h。　　2、通过Western blot证实AdPSCA转染DC后，DC表达PSCA蛋白。　　3、PSCA重组腺病毒转染诱导DC出现典型形态学变化;同时DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR阳性细胞率升高;AdPSCA提高了IL-12表达量同时抑制了IL-10表达;同时AdPSCA提高了DC迁移能力。　　4、AdPSCA-DC提高了T细胞增殖能力，同时能够大量诱导CD8+CTL产生。　　5、Western blot发现前列腺癌细胞PC-3高表达PSCA蛋白，前列腺癌细胞LNcap较高表达PSCA蛋白，前列腺上皮细胞RWPE-1低表达PSCA蛋白。　　6、AnnexinⅤ-FITC/PI双染细胞凋亡检测发现AdPSCA-DC-CD8+CTL最佳PC-3肿瘤细胞杀伤比例为40∶1。AdPSCA-DC-CD8+CTL对RWPE-1、LNcap和PC-3的杀伤比例达到8.87％±3.12、30.19％±4.13和52.60％±5.78，依次是Adnull-DC-CD8+CTL的1.31倍、4.54倍和7.37倍，同时是DC-CD8+CTL的1.81倍、5.81倍和10.31倍。　　7、酶联免疫斑点实验表明:PC-3细胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL高表达IFN-γ，LNcap细胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL较高表达IFN-γ，RWPE-1细胞刺激AdPSCA-DC-CD8+CTL弱表达IFN-γ;相关细胞刺激后，Adnull-DC-CD8+CTL和DC-CD8+CTL弱表达IFN-γ。　　8、AdPSCA-DC-CD8+CTL抑制PC-3细胞在Balb/c-nu/nu雄性裸鼠背部形成肿瘤。　　9、经AdPSCA-DC-CD8+CTL处理后，荷瘤裸鼠肿瘤体积比（4.89±2.26）明显低于PBS(27.43±2.76)、DC-CD8+CTL(25.74±2.10)和Adnull-DC-CD8+CTL(24.81±2.41)处理组，同时平均存活时间(37d)显著长于PBS(22d)、DC-CD8+CTL(22d)和Adnull-DC-CD8+CTL(22d)处理组;经过治疗后4组荷瘤裸鼠体重未见明显降低。　　10、AdPSCA-DC-CD8+CTL处理后，HE染色发现肿瘤组织出现明显病理学改变，免疫组织化学染色表明肿瘤组织中VEGF和Bcl-2表达量明显下调而Bax表达量明显升高。　　结论:　　1、本研究成功构建PSCA重组腺病毒载体。　　2、PSCA重组腺病毒载体转染促进了DC表型及免疫功能成熟，获得PSCA阳性DC。　　3、AdPSCA-DC促进了T淋巴细胞增殖和CD8+CTL产生。　　4、AdPSCA-DC-CD8+CTL能够有效杀伤PSCA阳性肿瘤，而对PSCA弱阳性细胞具有弱杀伤作用。　　5、AdPSCA-DC-CD8+CTL能够有效抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长和提高荷瘤裸鼠存活时间。