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在胰岛素调控条件下,GLUT4协助葡萄糖从细胞外顺浓度梯度,在囊泡的参与下进入细胞。Rab蛋白(Ras超家族的成员)参与这一重要生理过程,而TBC家族蛋白质参与Rab的GTPase活性调节。因此,通过研究TBC蛋白质有助于深入研究血糖调节作用的分子机制,从而发现治疗血糖代谢相关疾病(例如:2型糖尿病)的新的药物靶点。目前TBC蛋白质家族成员TBC1D1、TBC1D4、TBC1D13已被证实参与GLUT4囊泡转运过程,调节胰岛素信号途径,但未见TBC1D15参与该过程的相关报道。先前研究表明,从条纹斑竹鲨中发现的天然活性肽是TBC1D15的N端的一部分序列,天然的鲨肝肽(Active peptide from shark liver,APSL)能够保护受损肝脏,改善并修复胰岛β细胞损害。基因序列比对结果表明:条纹斑竹鲨TBC1D15与人TBC1D15相似性为67%,TBC域相似性高达91%,具有高度同源性;因此,我们推测TBC1D15很可能参与胰岛素信号途径,调节血糖代谢过程。利用CRISPR-Cas9系统敲除HeLa细胞中的TBC1D15基因,从细胞水平上研究TBC1D15是否与糖代谢相关。本研究基于CRISPR-Cas9系统开展构建基因敲除细胞系的构建。首先针对TBC1D15的外显子进行gRNA设计,运用Cas9(D10A)蛋白通过配合一对gRNA分别靶定到靶定位点的DNA互补链中,从而形成功能性的双链断裂,产生双切口的原理(降低脱靶效应)设计并获得7对gRNA序列,随后将这7对gRNA序列分别构建至pX462(含嘌呤霉素抗性基因)载体中,通过测序及比对验证,成功构建了7对含gRNA的重组质粒。MTT实验获得HeLa细胞的嘌呤霉素筛选浓度为1μg/mL。随后,将每对质粒分别转染He La细胞,转染24h后,换成含嘌呤霉素的培养基筛选细胞株,待阴性对照即正常He La细胞全部死亡后,用有限稀释法挑选出单克隆细胞株,随后进行扩大培养并进行验证实验。通过形态学观察获得一株形态异常的单克隆细胞株,且生长速度较正常HeLa细胞慢,随后利用Western Blotting、qRT-PCR、基因组PCR分别验证TBC1D15的表达、转录和基因组水平的变化。Western Blotting未检测到该细胞株TBC1D15的明显表达,qRT-PCR表明其mRNA转录水平上降低90%,基因组PCR显示该细胞株TBC1D15有大片段的删除。这些结果表明该株细胞为一株TBC1D15基因敲除的细胞株。通过2-NBDG葡萄糖荧光类似物培养后,经流式细胞仪检测,证实:在细胞水平上,所得到的TBC1D15基因敲除细胞株糖吸收降低,提示TBC1D15在糖吸收中发挥重要作用。