人体共生副溶血链球菌特异性定量PCR方法的建立及人肠道菌群中汞抗性基因的分布

来源 :上海交通大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:robinjwj
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副溶血链球菌(Streptococcus parasanguinis)是一种在人群中广泛分布的人体共生细菌。本研究基于管家基因gro EL序列,设计了Spa93f-Spa525r和Spa146f-Spa525r两对S.parasanguinis特异性的PCR引物,并建立定量PCR方法,对人口腔和肠道中的副溶血链球菌进行定量分析。NCBI在线的Blastn比对结果表明,每个引物都与NCBI nucleotide collection database中的S.parasanguinis的gro EL基因序列具有100%的一致性。从专门收录原核和真核生物的gro EL基因序列的cpn DB数据库中下载来自不同链球菌菌种的所有的866个gro EL基因序列,导入模拟PCR(Simulated PCR,SPCR)算法,预测在使用每对引物的情况下、哪些链球菌的groEL序列能够产生PCR扩增产物;结果显示两对引物都只扩增S.parasanguinis的gro EL基因,而不扩增其他链球菌菌种的gro EL基因。使用每对引物,分别以6个受试者的唾液DNA为模板进行PCR,并对每个PCR反应的扩增产物进行克隆测序。系统发育分析表明,克隆序列全部隶属于S.parasanguinis,这个结果进一步说明了两对引物的特异性;另外,序列分析表明每个受试者口腔中包含多个不同的S.parasanguinis菌株。通过将不同浓度的S.parasanguinis细胞掺入(Spike)人的粪便样品中,我们发现两对引物的实时定量PCR(q PCR)的定量极限为5 to 6 log10 gro EL copies/g粪便。分别使用两对引物,对人粪便中S.parasanguinis进行q PCR,其定量结果与宏基因组测序确定的这些样品中的S.parasanguinis丰度显著相关。两对引物的q PCR结果都显示健康人唾液中的S.parasanguinis丰度高于牙周炎患者。在人粪便和唾液中,两对引物确定的S.parasanguinis的丰度具有显著的相关性。我们的研究结果表明,两对S.parasanguinis特异性PCR引物可以用于人类唾液和粪便S.parasanguinis的定量分析。为了评估人肠道菌群对具有严重毒性的有机汞和Hg2+的代谢能力,我们利用隐马尔可夫模型(HMM profile)的方法,选择本实验室测序并组装的109名中国肥胖儿童粪便菌群的元基因组序列数据集,研究人肠道中汞抗性基因mer基因的丰度和分布。在这些中国儿童的肠道菌群中,没有发现编码有机汞裂解酶(organomercury lyase)的mer B基因,但存在编码将汞离子和苯基汞转运至细菌细胞内的转运蛋白(mercuric transport protein)mer T基因、以及编码汞离子还原酶(mercuric reductase)的mer A基因。mer A基因在77.98%的儿童的肠道中都存在,平均丰度为3.71±7.19。肠道菌群中的mer A基因主要来源于革兰氏阳性的链球菌(Streptococcus),以及革兰氏阴性的假单胞菌(Pseudomonas)、大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、肠杆菌(Enterobacter)和志贺氏菌(Shigella)。其中,来源于链球菌(Streptococcus)和大肠杆菌(E.coli)的mer A基因丰度较高,分别为1.31±2.62和1.39±4.35,在66.97%和48.62%的儿童的肠道中存在;来源于假单胞菌(Pseudomonas)、肠杆菌(Enterobacter)的mer A基因丰度很低,丰度分别为0.13±0.49和0.09±0.30,分别在11.93%的儿童的肠道中存在。这些结果表明,利用HMM profile的方法没有在中国肥胖儿童肠道菌群元基因组测序数据中找到mer B基因,我们需要在更大的肠道菌群数据集中或者使用其他方法探索人肠道菌群是否具有去甲基化的能力;但是肠道菌群可以将有毒的Hg2+还原成低毒的Hg0
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