论文部分内容阅读
锑(Antimony)是一种剧毒的类金属,锑中毒会导致人体心肌衰竭、肝坏死等疾病。自然界中有些微生物能够通过氧化毒性强的Sb(III)至毒性弱的Sb(V)来解毒。本课题组前期发现在锑氧化型细菌Agrobacterium tumefaciens GW4中Sb(III)的氧化是锑氧化酶AnoA催化的酶促和H2O2介导的非酶促锑氧化共同组成的,但对于AnoA表达的调控机制还尚未阐明并且目前微生物Sb(III)压力下的响应机制也尚未报道。本论文开展了菌株GW4在不加锑与加50μM Sb(III)条件下的比较蛋白质组研究,然后利用分子生物学技术研究锑氧化酶AnoA的调控机制,并分析了锑压力下的代谢路径。通过蛋白质组学和质谱测序鉴定得到21个加锑差异表达蛋白质均上调表达,根据KEGG功能分类,分别属于锑氧化及外排、碳代谢、脂类代谢、氨基酸代谢及膦酸酯代谢和磷酸盐转运等。其中,我们发现在加锑条件下磷酸盐转运蛋白Pst S2的上调表达,前期报道PstS蛋白受磷酸盐调控蛋白PhoB的调控。PhoB为全局性调控蛋白,我们推测磷酸盐调控系统可能与Sb(III)氧化存在相关性。基因组分析发现菌种GW4有两套磷酸盐调控系统。将位于砷基因岛上一套命名为1,该基因簇中的磷酸盐调控蛋白基因phoB1位于磷酸盐转运系统pstBACS1的下游,方向相反;将远离砷基因岛的另一套命名为2,该基因簇中的磷酸盐调控蛋白基因phoB2位于磷酸盐转运系统pstBACS2的下游,方向相同。本论文主要结果如下:(1)通过报告基因融合实验,我们检测到GW4中的磷酸盐调控蛋白基因phoB1受Sb(III)诱导效果不明显,但phoB2能够受Sb(III)显著诱导;(2)在加Sb(III)条件下检测菌株GW4、GW4-ΔphoB1、GW4-ΔphoB2、GW4-ΔphoB1/phoB2中锑氧化酶基因anoA的酶活,结果发现较野生型GW4中anoA的酶活相比,缺失phoB2基因anoA的酶活性受到明显的抑制,phoB1基因的缺失使anoA的酶活性略有下降,而双敲除株GW4-ΔphoB1/phoB2中anoA酶活几乎丧失;(3)对各个菌株进行生长和锑氧化实验结果表明,单敲除株在50μM Sb(III)浓度下生长、锑氧化均不受影响,GW4-ΔphoB1/phoB2双敲菌株在不影响生长的情况下锑氧化效率明显降低;(4)对各个菌株在加Sb(III)条件进行胞内H2O2含量测定,结果显示GW4-ΔphoB1中H2O2含量较GW4显著升高,GW4-ΔphoB2中H2O2含量极显著升高,互补株均回复表型。这些结果表明单敲除株氧化速率没有降低很可能是由于H2O2发挥了Sb(III)氧化作用;而双敲除株中H2O2含量虽比野生型高,但仍低于GW4-ΔphoB2,并不足以弥补anoA的作用,因此氧化速率减慢;(5)细菌单杂交和EMSA等方法证明PhoB1、PhoB2能够与anoA启动子区DNA在体内和体外相互作用,并确定了结合位点。以上结果表明,磷酸盐调控蛋白PhoB1与PhoB2均对锑氧化酶基因anoA有一定的调控作用,但是PhoB2的调控作用更强。该研究阐明了菌株GW4中锑氧化酶基因anoA的调控机制,并解析了异养型细菌对锑的压力响应机制,为利用微生物进行锑污染治理具有十分重要的理论价值。