研究背景:近年来越来越多的实验室研究和流行病学研究表明,二甲双胍作为一种口服的双胍类降糖药在肿瘤的预防和治疗中发挥潜在作用。然而,我们对于二甲双胍在肿瘤防治中的适应症和作用机制尚无明确认识。研究方法:在本研究中,我们进行了基于CRISPR全基因组文库（Brunello文库）的敲除负性筛选,以期能够识别出潜在的与二甲双胍协同抑瘤的靶基因。将二甲双胍未作用组的细胞和作用18天的文库细胞收集起来提取DNA,通过二代测序比较识别出潜在基因（sgRNA,single guide RNA）序列,即实验组和对照组相比,实验组细胞中的候选基因存在缺失。进一步地,通过生物化学方法、分子生物学方法、代谢组学方法和裸鼠体内实验等方法阐释了候选基因中潜在的靶基因和二甲双胍协同作用的机制。研究结果:我们通过小RNA干扰的方法敲降候选基因集中的一些细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）基因,包括CDK1、CDK4和CDK6。通过比较敲降组和未敲降组细胞在二甲双胍作用下存活的情况,我们发现敲降组细胞对于二甲双胍更为敏感,这一现象证实了二甲双胍和CDKs抑制存在潜在协同抑瘤作用。此外我们在药物水平验证了 CDKs抑制剂——Abemaciclib与二甲双胍的协同作用,该药物目前用于多项临床试验,在肿瘤治疗领域有着广泛的潜在应用价值。体外体内实验表明,与单一用药相比,同时使用abemaciclib和二甲双胍可以显著抑制肿瘤细胞的生长。与单一使用abemaciclib相比,同时使用abemaciclib和二甲双胍并未引起明显的细胞周期改变。进一步实验表明,与单一用药相比,abemaciclib和二甲双胍联合使用可以造成明显的代谢改变,主要表现为脂肪酸氧化、三羧酸循环和天冬氨酸代谢等方面的改变。分子生物学实验表明协同作用的代谢改变由mTOR信号通路被抑制所介导。同时抑制mTOR信号通路可以促进二甲双胍和abemaciclib的协同作用。结论:总而言之,我们的研究表明二甲双胍在肿瘤领域有着广泛的潜在应用价值,联合应用二甲双胍和CDKs抑制剂在肿瘤的预防和治疗领域成为一种极具吸引力的治疗选择,并在未来的临床应用中具有潜在的临床价值。研究背景:近年来,关于食管鳞癌恶性转化的机制研究越来越多,大多聚焦于基因组水平和蛋白水平。关于食管上皮内瘤变进展为肿瘤的分子改变少有研究,特别是这一恶性转化过程中的表观遗传学改变研究仍然缺乏。研究方法:为更加系统的探索食管上皮内瘤变进展为肿瘤这一过程中的基因甲基化改变,我们针对病人来源的肿瘤组织、上皮内瘤变组织和非上皮内瘤变组织进行了全基因组重亚硫酸盐测序分析。此外通过TCGA数据库分析和免疫组织化学技术来进一步分析肿瘤样本中TGFBR2的甲基化和表达情况。通过荧光定量PCR技术、western blot、流式细胞术和动物模型探索食管鳞癌细胞中TGFBR2启动子区的甲基化相关机制。研究结果:基于全基因组重亚硫酸盐测序技术,我们通过比较非肿瘤样本和肿瘤样本鉴定出969个差异甲基化区域（differentially methylated regions,DMR）,比较正常食管组织和上皮内瘤变组织鉴定出1293个DMRs,比较上皮内瘤变组织和肿瘤组织鉴定出1838个DMRs。在这些差异甲基化基因中,作为TGF-β信号通路中重要的基因TGFBR2,其启动子区域的甲基化与食管鳞癌的恶性转化密切相关。针对病人组织的免疫组化分析发现与癌旁正常组织或上皮内瘤变组织相比,肿瘤组织中的TGFBR2的表达下降。与永生化的食管上皮细胞系Het-1A相比,多株食管鳞癌细胞系的TGFBR2的mRNA下调。使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷（一种DNA甲基化转移酶抑制剂）处理食管鳞癌细胞可再次激活TGFBR2基因的表达。使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理食管鳞癌细胞KYSE-150或在KYSE-150细胞中过表达TGFBR2均可以诱导细胞周期阻滞进而抑制细胞的增殖。此外,体内实验中过表达TGFBR2可显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:食管鳞癌中的TGFBR2基因甲基化与食管鳞癌的恶性进展密切相关,这可以帮助我们进一步理解基因启动子区域甲基化与食管鳞癌的关系,TGFBR2基因的甲基化有可能作为预测食管上皮内瘤变恶性进展的潜在标志物,同时探索TGFBR2抑制剂有可能作为预防食管鳞癌恶性进展的潜在靶点。