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研究背景:反常性痤疮（Acne inversa,AI,OMIM:142690）又名化脓性汗腺炎（hidradenitis suppurativa,HS）,是一种复发性、慢性、炎症性皮肤病,常常发生在患者皱褶以及大汗腺分布密集的部位,包括腋下、颈后及臀部等,愈合后常留下大量瘢痕。患者常常于青春期后发病,早期的临床表现以红色丘疹、结节为主,膨胀的毛囊漏斗部及表皮囊肿破裂释放的内容物引发大量的局部免疫反应可继发严重的炎症反应,导致疼痛的炎症、脓肿形成并在后期形成窦道和瘢痕。AI在病理生理学的主要缺陷在于毛囊上皮,毛囊口闭塞、毛囊导管破裂和异物型免疫反应是临床上AI发生发展的必要条件。特定的遗传特征和环境因素,如吸烟、肥胖和微生物定植等,都有助于AI的发病。毛囊口阻塞是由漏斗部位上皮细胞过度角化和增生引起的,堆积的细胞碎片导致囊肿最终的形成,但也有可能是毛囊导管内缺氧,破坏了毛囊角质形成细胞的正常终末分化,从而导致毛囊口堵塞。造成毛囊阻塞的病因及发病机制并未研究十分清楚,目前最热门的学说认为这是由于γ-分泌酶复合物（γ-secretase complex,GSC）基因突变从而导致Notch无法正常剪切导致的。经调查,约30%-40%的AI患者有明确的γ-分泌酶突变,遗传方式一般为常染色体显性遗传,我们推测剩余60-70%的AI患者可能有其他基因的新生突变或隐性遗传突变所引起,通过一系列的验证和功能学研究深入探讨新的基因突变与疾病发生发展的关系,特别是在过去工作的基础上,探索新发现的基因突变与γ-分泌酶以及Notch、EGFR信号通路的关系,进一步丰富对AI及相关疾病发生机制的认识。研究目的:本课题通过收集有家族史及无家族史AI患者的外周血及临床资料,用以建立和完善AI患者的遗传数据库。将家族性AI患者外周血DNA的全外显子组测序/全基因组测序数据进行整理分析,以完善GSC的突变数据库;将有家族史和无家族史的AI患者的临床特征进行对比分析,并对散发性AI患者外周血DNA的全外显子组测序数据和结果,进行生物信息学分析,对不同临床表现的散发性AI患者进行突变基因的筛选;根据散发性AI患者的生物信息学结果,发现和探索散发性AI患者中可能存在的致病基因,并探究其作用机制。实验方法:1.通过筛查皮肤科门诊就诊的患者,收集家族性和散发性AI患者的临床资料、外周血及部分患者的皮肤组织样本,在建立AI患者遗传资源库的基础上,进行AI发病机制和致病基因的研究。2.提取家族性AI患者外周血的DNA,通过WES测序确定GSC的突变位点,设计对应的引物应用PCR扩增、Sanger测序后比对分析产物的碱基序列,找出GSC基因致病突变;同时通过收集家系中其他成员的血液DNA,再次进行鉴定以描绘出遗传家系图谱。3.对30例散发性AI患者的全外显子组测序结果进行生物信息学分析,将可能的致病基因进行归纳和搜索,并通过Sanger测序方法加以验证。随后对散发性AI患者根据皮损发生部位将散发性AI患者分为两组,即只有臀部受累组（臀型）和没有臀部受累组,根据生物信息学分析结果,寻找两组AI患者的差异基因;对上述寻找到的可能致病基因进行进一步探究和验证,结合文献分析重点讨论其中1个候选基因,即NCoR2对AI的致病作用,首先采集这些在患者父母DNA进行上检测突变检测的基础上以确定致病基因突变的特异性与遗传方式;通过检测患者血液或皮损组织中目标基因的mRNA和蛋白质水平、采用体外细胞实验和基因敲除小鼠等技术,研究该致病基因突变在散发性AI发病中的作用机制。实验结果:1.收集到3个家族性AI家系及30例散发性AI患者,采集患者血液标本及部分患者皮损组织标本。2.通过对家族性AI患者家系分析及GSC测序结果分析,发现新的突变位点（NCSTN c.10021003del、NCSTN c.1603C>G和 NCSTN c.16371648del 以及PSENEN c.108G>A）,遗传特点呈常染色体显性遗传,先证者皮损中NCSTNmRNA表达水平降低。3.通过对散发性AI患者全外显子组测序,并对不同临床表型之间差异基因进行探索,筛选到与可能与臀型患者临床表现相关的10个基因分别为PPP4R2,DZIP1L,GRM6,HBP1,SLC22A20,PRTG,FAM174B,IST1,TRIP10 和 BAGE4,其中PRTG及IST1可能对表型有影响。4.通过突变位点Sanger测序,我们在患者父母外周血DNA中未检测到NCoR2突变,NCoR2基因突变在家系中是新生突变（de Novo）,并且发现皮损区域NCoR2蛋白水平明显降低;体外敲减NCoR2细胞实验发现细胞迁移加速,细胞的黏附、分化及凋亡指标与对照组相比均明显下降;靶向皮肤敲除NCoR2的小鼠出现丘疹,小鼠皮损处组织病理学染色显示角质层增厚。结论:1.收集到了较多AI患者的临床资料,进一步扩大和完善了 AI遗传资源库。2.AI是具有遗传异质性的遗传性皮肤病,发现新的GSC突变NCSTN c.10021003del,NCSTN c.1603C>G,NCSTN c.16371648del 以及 PSENEN c.108G>A与家族性AI的发病相关。携带GSC突变的患者与无家族史的散发性AI患者相比,家族性AI患者皮损受累部位更多,表型更重,Hurley分级更高,发病年龄更早。3.筛选到了 2个差异基因PRTG及IST1可能与AI患者臀型的发病相关,也可能提示疾病的转归以及癌症发生的风险。4.在5个散发性AI家系中发现NCoR2基因突变,并在其父母中均未被发现,呈新生突变（de Novo）的模式。体外培养细胞敲减NCoR2基因可影响角质形成细胞的生物学功能及细胞末期分化,可能是通过Notch/EGFR信号通路起到AI的致病作用,在实验动物中验证NCoR2基因具有致病作用。