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生物体内过氧亚硝基的产生能引起蛋白质的结构改变,导致癌变和病毒的进一步变异,从而引发多种疾病如:风湿性关节炎、心脏病、脓毒性休克、动脉硬化等等。由于过氧亚硝基寿命短暂、难于分离,对过氧亚硝基的检测,尤其在生物体内的检测一直是一个极大的挑战。迄今,虽然已有多种检测过氧亚硝基的方法,但是都达不到高选择性的识别过氧亚硝基的目的,而且多数方法都只能做体外检测,还没有一种方法可以在活生物体内对过氧亚硝基进行有效的检测。因此,寻找一个生物体内高选择性地检测过氧亚硝基的方法迫在眉睫。
荧光探针由于具有高的灵敏度、回应快速、可以借助荧光显微镜高分辨的观测等优点,被广泛用作生物体内的信号分子。虽然已有检测过氧亚硝基的荧光探针,但是都没有很好的选择性。为了解决这个难题,就需要设计一个反应,专一地捕获过氧亚硝基阴离子,然后基于此专一反应,设计合理的荧光探针对过氧亚硝基进行检测。
最近我们找到一个化学反应(Scheme2-4)可以高效地与过氧亚硝基阴离子反应,而细胞产生的其它活性氧化物(ROS)不会参与反应。因此,我们利用这一化学反应设计合成了荧光探针ProbeⅠ。但是由于荧光团Fluroescein部分对过氧亚硝基极不稳定,以失败告终。从中吸取经验,改荧光团为Dichlorofluroescein合成了荧光探针ProbeⅡ。在ProbeⅡ检测过氧亚硝基的实验中,观测到了2倍的荧光强度的增加,但是由于ProbeⅡ本身有荧光背景,不适合细胞内过氧亚硝基的检测。在此基础上,我们设计合成了荧光探针ProbeⅣ,解决了荧光背景高的问题,而且观测到5.5倍荧光强度的增加,比之前的ProbeⅡ灵敏度有很大提高;而且荧光探针ProbeⅣ可以从众多的ROS中,选择性地识别并检测过氧亚硝基。细胞实验的结果证明ProbeⅣ可以从·NO、O2·-、ONOO-中识别ONOO-,并且非常灵敏地观测到了神经细胞缺氧状况下产生的过氧亚硝基,这是迄今为止第一次在活的细胞内清晰地观测到过氧亚硝基。
为了提高检测的灵敏度,我们设计合成了荧光探针ProbeⅤ和ProbeⅥ,希望这种结构可以提高释放荧光团的效率。但是实验的结果并不理想,我们猜测主要原因是反应生成的中间体很难完全释放出荧光团,从而导致荧光强度增加不多。
另外,我们还合成了新一类荧光团化合物69,希望其相应的荧光探针可以更有效地、高敏感地检测过氧亚硝基,对这类荧光探针的合成和研究仍在进行中。
综上所述,我们成功地发展了一类新型荧光探针用于高效、专一地检测化学和生物体系中产生的过氧亚硝基,第一次成功地实现在活的细胞内检测细胞自身产生的过氧亚硝基,这一发现,为病理药理学、生物学等各个领域对过氧亚硝基的检测提供一个更为有效的方法。