背景和目的近年来一些病例报告显示：患有根尖周炎或根尖脓肿的年轻恒牙,经治疗后牙根尖持续发育成形。传统观点认为：根尖周炎伴发瘘管及根尖透射影像,牙髓活力测试阴性时牙髓已全部坏死,牙根将停止发育,显然,传统知识难于解释此现象。学者推测根管内及附近组织中一定还存在能促使牙根继续发育成形的因素。由此提出“血管重建”假说,并认为：年轻恒牙宽大的根尖提供了从根管腔到根尖周组织的良好通路,当仅有部分牙髓感染时,可能引发根尖周疾病；然而由于通畅的血液循环,牙髓和根尖乳头中的干细胞也许仍存活于有感染的组织中,并可发生牙髓再生及根尖成形。2006年,Sonoyama[8]从阻生智齿的根尖乳头中分离得到具有高度增殖能力和多向分化潜能的干细胞,将其命名为根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)。研究表明,与牙髓干细胞相比(dental pulp stem cells, DPSCs), SCAP表现出更高的溴脱氧尿苷吸收率、数量倍增能力,更强的细胞迁移能力以及更多的细胞阳性表达STRO-1(间充质干细胞表面标志)。SCAP经成骨、成脂和神经方向诱导后,具有向成骨细胞、脂肪细胞和神经细胞分化的能力。体外扩增的SCAP以羟基磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatite/tricalcium phosphate,HA/TCP)为载体,在免疫缺陷小鼠体内能形成牙髓牙本质样复合体。Huang以聚乙丙交酯(poly-D,L-lactide and glycolide, PLG)为载体,将SCAP接种于载体上,利用根管片段模型进行牙髓再生的实验,结果显示不仅有含血管的牙髓样组织生成,更重要的是,原有牙本质和MTA表面有一层连续均匀的牙本质样组织生成。表明人SCAP分化为成牙本质样细胞后,进而形成牙本质。患有根尖周炎或根尖脓肿的年轻恒牙中存活的SCAP可能具有促使病变根尖周组织继续发育成形的作用。哺乳动物的牙根发育是一个长期的过程,包括牙根发育启动、牙根延长并建立牙周附着关系、牙齿萌出直至咬合关系建立、最后牙根发育完成、根尖孔闭合。在这一过程中,牙根进一步发育同时伴有牙周组织形成及牙周附着的建立,从而使牙根及牙周组织形成一个功能单位被锚定在颌骨上。牙根及牙周组织共同的发育依赖于发育期牙根的根端组织持续增殖并分化。在结构上,发育期牙根的根端组织包含双层上皮细胞构成的鞘样结构,即Hertwig上皮根鞘(Hertwig’s epithelial root sheath,HERS),上皮根鞘将其下方的外胚间充质组织划分为牙乳头及牙囊。以往的研究表明牙囊可分化形成牙周膜、牙骨质和牙槽骨等牙周组织,而牙乳头形成牙本质及牙髓,Hertwig上皮根鞘则作为牙根形成的诱导者和调节者,调节牙根大小、形状和牙根数。学者发现调节牙根及牙周组织发育的信号分子,如BMP、同源异型盒基因家族Msx和Shh、FGF、 GDF均定位于发育期的根端组织。推测可能通过细胞-细胞及细胞-基质间的相互作用并由此产生的信号分子使牙根和牙周组织形成细胞的前体细胞分化,从而促成牙根和牙周组织的形态发生。牙齿萌出前,牙囊包围着成釉器与牙乳头组织。然而在牙齿萌出后,牙囊仅居于发育期牙根根端,与牙乳头相连,两种组织间失去了牙胚发育早期所存在的组织学分界。考虑到牙根、牙周组织在发育上的同步性以及二者功能上的完整性,学者将发育期的牙根根端组织命名为“根端发育复合体”(developing apical complex, DAC)。学者将SD大鼠DAC与陶瓷化骨混合后,移植到大鼠肾包膜下,4W后可见牙本质、牙骨质、牙周膜及骨样组织形成。由此推测DAC在牙根发育时期,不仅继续形成牙根,同时也形成牙周组织,以建立结构完整的牙根／牙周复合体,从而行使咀嚼功能。学者利用小型猪动物模型,外科手术去除牙根发育初期的牙乳头后,尽管牙髓组织完整,但牙根停止发育；相比之下,含有牙乳头的其它牙根生长和发育均正常。由此推测牙乳头在牙根发育中起着重要作用。牙乳头作为“根端发育复合体”的一部分,其单独作用,是否也能形成牙周组织呢?本课题从人未发育完全的年轻恒牙中分离培养SCAP和牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs),并分别测定其克隆形成率、细胞增殖能力,并于体外诱导培养条件下,观察其矿化和向脂肪细胞分化的能力,以及测定其在体外是否表达牙周膜相关标志,观察SCAP在体外是否表现牙周特性。旨在探索来自发育中组织的SCAP,是否与根尖区牙周组织的形成有密切联系,为牙根及牙周组织共同发育机制提供一定的依据。方法1、SCAP与PDLSCs的收集和培养选取16-20岁健康患者牙根未发育完全(牙根发育2/3)的阻生智齿,依据Tanaka等的实验方法,采用组织贴块法培养细胞。将从同一颗牙切取的牙乳头组织和牙周膜组织充分剪碎后接种于细胞培养瓶内培养。2、免疫荧光检测干细胞表面标志STRO-1分别取第1代的两种干细胞,用免疫荧光法检测两种干细胞是否表达干细胞表面标志STRO-1。3、SCAP与PDLSCs(?)细胞克隆形成实验在6孔板中按200个细胞/孔的密度分别接种第1代的两种干细胞,连续培养10d后,结晶紫染色观察细胞克隆数。4、SCAP与PDLSCs生长曲线的测定分别取第2代SCAP和PDLSCs的单细胞悬液,MTT法测各孔OD值,连续测8天,以时间为横轴、每天的平均OD值为纵轴绘制生长曲线。5、SCAP与PDLSCs的矿化能力取第3代两类干细胞,在矿化诱导液中分别诱导7d、14d和21d后,茜素红染色观察矿化结节形成情况,免疫荧光染色法检测矿化相关标志物ALP、BSP和OC的表达情况,以及荧光定量PCR检测这三种标志物在两种干细胞中的表达差异。两类干细胞在普通培养基中培养60d后,茜素红染色观察钙结节形成情况以及荧光定量PCR检测矿化相关标志物在两种干细胞中的表达差异。6、SCAP与PDLSCs的成脂诱导分化取第3代两类干细胞,在成脂诱导液中分别诱导21d后,油红O染色观察脂滴形成情况。7、SCAP与PDLSCs细胞膜片的制备取第3代两类干细胞,在含维生素C的诱导液中诱导14d后,光镜下观察细胞外基质形成情况。剥离细胞膜片,制成石蜡切片,HE染色观察细胞膜片形态。8、RT-PCR检测SCAP与PDLSCs的牙周膜标志物分别取两类干细胞的第3、5、7、9代,RT-PCR检测牙周膜标志物S100A4和periostin。9、经矿化诱导后S100A4的变化荧光定量PCR检测SCAP与PDLSCs在矿化诱导培养基中培养21d后,S100A4与诱导前的变化。10、统计学处理采用SPSS13.0统计软件数据进行两个样本t检验,结果以均数±标准差(X±S)表示,p<0.05表示差异有显著意义。结果1、细胞形态及生长情况细胞约5-7d从组织块周围爬出,两种细胞形态相似,均呈短梭、多角形。传代后细胞呈成纤维细胞形态,细胞大小和形态趋近一致。2、免疫荧光检测干细胞表面标志STRO-1第1代SCAP和PDLSCs均阳性表达STRO-1。3、SCAP与PDLSCs细胞克隆形成实验SCAP和PDLSCs均能形成克隆细胞团,SCAP形成的克隆数高于PDLSCso4、SCAP与PDLSCs生长曲线的测定两种干细胞在第3天进入对数生长期,SCAP的增殖活力明显强于PDLSCs。5> SCAP与PDLSCs的矿化能力两种干细胞经成骨诱导后,细胞复层生长、聚集成簇,茜素红染色均可见钙结节形成,随着诱导时间增加,钙结节逐渐增多。免疫荧光显示两种干细胞均阳性表达矿化相关标志物ALP, BSP和OC,荧光定量PCR显示这三种标志物在SCAP中的表达均高于PDLSCs.细胞在普通培养基中培养60d后,茜素红染色均阳性,且SCAP中ALP, BSP和OC的基因表达均高于PDLSCs。6、SCAP与PDLSCs的成脂诱导分化SCAP和PDLSCs在成脂诱导体系的作用下,21d左右可见细胞中出现串珠样透明高亮度点,并有部分融合,油红-O染色呈阳性。7、SCAP与PDLSCs细胞膜片的形成SCAP和PDLSCs经诱导14d后,大量细胞外基质形成,成熟膜片形成,组织学检查显示两种膜片较为均匀,细胞间富含大量的细胞外基质。8、RT-PCR检测：SCAP与PDLSCs的牙周膜标志物RT-PCR显示第3、5、7、9代的两种干细胞均表达牙周膜标志物S100A4和periostin。9、经矿化诱导后S100A4的变化经矿化诱导后,S100A4在SCAP和PDLSCs表达均下降。结论本实验成功分离培养SCAP与PDLSCs,两种细胞具有干细胞特性,表达干细胞表面标志物,且具有矿化、成脂分化的能力。SCAP的克隆形成能力、细胞增殖能力和矿化能力均高于PDLSCs。与PDLSCs一样,SCAP也表达牙周膜相关标志物,证实SCAP在体外表现牙周特性。SCAP也许可作为组织工程牙周再生的干细胞来源。