甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育恢复基因的精细定位

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油菜杂种优势利用是提高产量、改良品质的有效途径。隐性基因上位互作控制的核不育系于上世纪90年代被育种家们发现,多年研究表明该不育系育性稳定、彻底、恢复源广,用该不育系配制杂交种可以免除人工拔除50%不育株的麻烦,因此将成为油菜杂种优势利用的重要途径。本研究室选育的核不育材料7-7365A属于这种遗传机制。本研究以7-7365AB两型系为材料,围绕雄性不育育性恢复基因(Ms3或Ms4)开展了以下工作:1)将13个标记的差异片段回收、克隆、测序并根据序列设计SCAR引物。结果显示:共有5个AFLP标记成功转成了SCAR标记,并且分布在目的基因的两侧;2) 2006年3月田间取样1997份(不育株),用获得的SCAR标记扫描单株,对这些标记进行了精细定位;2006年7月田间取样1861份(不育株),用上述标记再次扫描,重复验证。结果显示:标记与目标基因的相对位置跟初步定位结果相符,在两个群体中两侧最近标记都是SCAR11(AFLP11)和AFLP16,SCAR11的遗传距离分别为0.3cM和0.1cM,AFLP16的遗传距离分别为0.1cM和0.4cM;3)通过PCR walking技术分离了最近两个标记序列的侧翼序列。BLAST分析显示:有5个标记的序列在拟南芥中找到了同源序列,它们位于拟南芥同一条染色体上。最近两个标记的序列在延长之后依然能够找到同源序列,并且位置不变;4)以标记锁定的拟南芥区域的序列为基础,查找了甘蓝型油菜同源序列,并根据这些序列设计了15对引物。结果显示:有1对显示出了多态性;5)对于一部分没有显示出多态性的引物,将其扩增片段测序。有些引物在不育亲本和可育亲本中扩增的片段序列完全相同,在这些序列内设计了正反两个方向的步行引物,从两个方向分离这些序列的侧翼序列。结果显示:同一种内切酶在两个亲本中酶切之后得到的序列没有发现插入或缺失,也没有酶切位点的差异;不同内切酶在同一个亲本中酶切之后得到的序列同源性较高,分析认为甘蓝型油菜基因组的复杂性导致染色体步行非常困难。
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