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研究目的:利用抗癌肽D-K6L9修饰RGD和NGR,获得RKL和NKL。利用荧光染料sulfo-Cy5.5-NHS酯标记新型探针,通过细胞免疫荧光试验和荷瘤鼠近红外荧光光学显像试验,验证并比较Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL的肿瘤亲和力。选择亲和力最佳者,利用原位脑胶质瘤模型,验证其用于原位脑胶质瘤术中定位的可能性。探索放射性核素68Ga标记DOTA-NKL的体内外研究,通过细胞摄取试验和肿瘤模型PET/CT显像试验,进一步验证68Ga-DOTA-NKL的肿瘤显像能力。研究方法:委托公司合成RKL、NKL和DKL。以碳酸氢盐溶液为缓冲液,将溶解于DMF中的sulfo-Cy5.5-NHS酯分别与三种多肽混合。利用HPLC分离纯化并获得Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL,冻干以备用。在细胞免疫荧光试验中,用溶解于500μL PBS溶液中浓度为50 nM的Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL溶液于37℃条件下孵育U87MG人脑胶质瘤细胞1 h。在阻断组,用Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL（50 nM）及相应的未标记的多肽（50μM）混合溶液于37℃条件下共孵育U87MG人脑胶质瘤细胞1 h。用DAPI染肿瘤细胞核后,用共聚焦激光扫描显微镜观察并拍照,验证探针与肿瘤细胞结合的特异性。建立U87MG荷瘤鼠模型,通过尾静脉分别给荷瘤鼠注射1.5 nmol Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL,探针注射后8 h内连续对荷瘤鼠进行近红外荧光光学成像。在阻断组,注射1.5 nmol Cy5.5标记多肽的同时,以20 mg/kg的量,向每只U87MG荷瘤鼠注射未标记的多肽,注射后3 h对荷瘤鼠进行近红外荧光光学成像,验证探针与肿瘤结合的特异性。比较Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL对细胞和肿瘤的亲和力,选择亲和力最高者,取1.5 nmol经尾静脉注射,8 h内对原位脑胶质瘤模型进行近红外荧光光学成像,检测探针对原位脑胶质瘤模型的显像能力,并验证其用于手术导航的可能性。用68Ga标记DOTA-NKL,利用HPLC验证68Ga对探针的标记率。取370 kBq68Ga-DOTA-NKL加入正辛醇和PBS的混合液中,振荡15 min后,12,500 rpm离心5 min,分别测定正辛醇和PBS中的放射性活度,计算68Ga-DOTA-NKL的脂水分配系数。将68Ga-DOTA-NKL分别与PBS溶液和小鼠血清共孵育,在4 h内利用HPLC连续测定溶液的放射化学纯度,验证探针的体外稳定性。利用细胞免疫荧光试验检测22Rv1人前列腺癌细胞和HT-29人结肠癌细胞的CD13受体表达水平。分别测定22Rv1细胞和HT-29细胞对68Ga-DOTA-NKL的摄取和排出情况。测定68Ga-DOTA-NKL对22Rv1细胞的亲和力,探究并计算68Ga-DOTA-NKL的IC50值。分别建立22Rv1和HT-29肿瘤模型,经尾静脉注射7.4 MBq 68Ga-DOTA-NKL,在3 h内对荷瘤鼠连续进行PET/CT显像。在阻断组,在注射7.4 MBq 68Ga-DOTA-NKL的同时,共注射未标记的NKL（20 mg/kg）2 h后进行显像,验证探针对肿瘤的靶向特异性。探针注射后2 h,对荷瘤鼠进行解剖,探究探针在荷瘤鼠体内的生物分布情况。研究结果:成功制备出Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL,三者在HPLC系统内的保留时间分别为19.39、19.44和19.40 min,产率分别为84.95%、96.12%和76.78%。Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL的最大吸收波长分别是675、673和673 nm,最大荧光发射波长分别是693、695和693 nm。细胞免疫荧光试验结果表明三种探针中,Cy5.5-RKL对U87MG人脑胶质瘤细胞的亲和力最高,Cy5.5-NKL对U87MG细胞的亲和力适中,Cy5.5-DKL亲和力最低,阻断组中,经过相应的未标记多肽的竞争性抑制,三种探针对U87MG人脑胶质瘤细胞的亲和力明显减低。探针对荷瘤鼠模型的近红外荧光光学成像结果表明,Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL对肿瘤显像的T/NT最大值分别出现在3、7.5和3 h,分别为7.65、4.89和5.43。阻断组中,Cy5.5-RKL、Cy5.5-NKL和Cy5.5-DKL对肿瘤显像在3 h产生的T/NT值从7.65±0.72、5.43±0.72和4.89±0.26降至0.73±0.06、1.07±0.04和1.40±1.23（P﹤0.05）。选取对U87MG细胞亲和力最高的Cy5.5-RKL进行原位脑胶质瘤显像,原位脑胶质瘤所在区域的荧光强度值高达（2.407±0.42）×1010,明显高于非肿瘤区荧光强度值（4.178±0.37）×109（P﹤0.05）。DOTA-NKL的68Ga标记率达94.51±0.49%。68Ga-DOTA-NKL脂水分配系数为1.34±0.07。68Ga-DOTA-NKL在血清和PBS溶液中都具有良好的稳定性。经细胞免疫荧光试验证实22Rv1人前列腺癌细胞为CD13受体阳性,其对68Ga-DOTA-NKL的两小时摄取率是3.15±0.04%,CD13受体表达阴性的HT-29人结肠癌细胞对68Ga-DOTA-NKL的两小时摄取率是1.03±0.003%（P﹤0.05）。细胞亲和力试验证实DOTA-NKL对22Rv1人前列腺癌细胞的IC50值为13.87 nM。利用68Ga-DOTA-NKL进行小动物PET/CT成像,探针注射后0.5、1、2和3 h,22Rv1人前列腺癌肿瘤组织对探针的摄取率分别为8.69±0.20、6.61±0.22、3.85±0.06和1.41±0.23%ID/g,而HT-29人结肠癌肿瘤组织对探针的摄取在探针注射后1 h仅为0.59±0.04%ID/g。研究结论:成功合成新型探针RKL、NKL和DKL。经过体外试验和体内试验证实,三种探针能够用于近红外荧光光学成像。三种探针中,RKL探针的近红外荧光光学成像靶本比值高、特异性高,进行模拟脑胶质瘤根治术的术中导航时,显像效果好,能够清晰显示脑胶质瘤与周围正常脑组织的边界。68Ga-DOTA-NKL具备良好的理化特性,在体内外对CD13阳性的肿瘤细胞及组织具有良好的靶向作用,有望成为PET/CT显像探针。综上所述,抗癌肽DKL修饰的RGD肽和NGR肽能够用于肿瘤的PET/CT显像,对肿瘤进行检测、分期和疗效监测,经修饰的RGD肽和NGR肽还能够用于肿瘤的近红外荧光光学成像,用于肿瘤根治术中对肿瘤进行定位,辅助切除肿瘤。