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【目的】牙周炎是一种影响牙周组织的炎症性疾病。宿主细胞可以采用多种防御策略来应答厌氧细菌的入侵,维持组织内的稳态,包括巨噬细胞的呼吸爆发以清除微生物,分泌趋化因子来招募全身防御细胞,以及产生生长因子来增强防御能力;这种炎症反应可能伴随着宿主细胞合成代谢和分解代谢的根本改变。在炎症代谢过程中,琥珀酸(Succinate)是一种成熟的促炎代谢物,琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)是将其脱氢转化的关键酶,而琥珀酸水平影响低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)的活性,HIF-1α是促炎基因表达的关键转录因子。本实验的研究目的是研究牙周炎发病过程中,Succinate-SDH-HIF-1α介导的代谢重组在慢性牙周炎发病过程中的作用,为认识和干预牙周炎提供理论依据和指导。【方法】首先在体外实验中,采用牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)刺激牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs),通过气相色谱-质谱仪(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分析代谢产物及代谢途径,并采用Seahorse XF96检测耗氧率(oxygen consumption rate,OCR)。收集健康以及慢性牙周炎患者的牙龈组织。患者需排除系统性疾病史;健康组纳入牙冠延长术、智齿拔除或者埋伏牙开窗需切龈的患者,临床无明显牙龈红肿,探诊出血(-),取材位点牙周探诊深度<3 mm,无附着丧失;慢性牙周炎组织取自半年内未行任何牙周相关治疗的Ⅲ度松动的重度牙周炎患者,患者半年内未服用任何会影响牙周状态的药物如免疫抑制剂和抗生素等。在前期研究基础上,通过q PCR和免疫组化等方法,分析糖代谢关键酶,如SDH、异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)、6-磷酸果糖激酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)和己糖激酶(hexokinase 2,HK2)等的表达是否存在差异。通过对牙龈标本的检测分析,进一步证明三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循环的代谢酶参与牙周炎的发病过程;采用P.gingivalis刺激PDLFs进一步探讨,通过q PCR和Western Blot等方法检测糖代谢中相关酶的表达情况,筛选出最有效的代谢酶SDH;使用丙二酸二甲酯(dimethyl malonate,DMM)和4-OI(4-octyl itaconate)抑制SDH以及SDH sh RNA慢病毒干扰SDH后,q PCR和ELISA法检测炎症细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemo-attractant protein-1,MCP-1)的表达情况。为了探索与代谢组学改变相关的通路,我们接下来通过Western Blot方法分析经典的促炎核因子κB(NF-κB)和HIF-1α通路的改变,2-methoxyestradiol(2-Me OE2)抑制HIF-1α通路;采用q PCR技术检测IL-1β、IL-6和MCP-1水平。【结果】在体外实验中,采用GC-MS分析,发现PDLFs在P.gingivalis处理24 h后发生代谢紊乱,其中33个代谢物如谷氨酰胺、谷胱甘肽和4-氨基苯酚下调,54个代谢物如柠檬酸、异柠檬酸和苹果酸上调;同时发现细菌感染影响多种途径,包括TCA循环、脯氨酸代谢、精氨酸、乙醛酸和二羧酸盐代谢,筛选出TCA循环为改变最明显的通路;通过Seahorse XF96检测OCR来分析P.gingivalis刺激PDLFs 24 h后线粒体呼吸,经过细菌处理后,PDLFs的基础呼吸、最大呼吸和备用能力都有所下降,这表明能量的产生从线粒体OXPHOS转移到了细胞糖酵解。临床标本的q PCR及免疫组化研究显示,与健康组相比,牙周炎组牙龈组织中SDH、IDH、PFKFB3和HK2表达增加。采用P.gingivalis刺激PDLFs,TCA循环中SDH表达明显增高,SDH活性随P.gingivalis感染复数增加而增加;研究P.gingivalis感染4 h后PDLFs中琥珀酸水平的变化,胞内琥珀酸呈感染复数依赖性升高,用共聚焦显微镜和流式细胞术分析可以观察到活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高;采用DMM和4-OI抑制SDH,SDH sh RNA慢病毒干扰SDH后,结果显示P.gingivalis诱导的炎症细胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的表达受到抑制,这提示我们抑制SDH能够有效抑制炎症。P.gingivalis刺激后可引起PDLFs中HIF-1α表达水平升高,脯氨酸羟化酶结构域2(prolyl hydroxylase domain 2,PHD2)水平降低,核因子红细胞相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)明显降低。然而,经典的促炎性NF-κB通路(单核细胞和巨噬细胞中TLR信号转导的主要通路)未被激活,表明HIF-1α是介导PDLFs代谢重组的主要通路;HIF-1α通路抑制剂2-Me OE2显著降低促炎细胞因子转录。因此,Succinate-SDH-HIF-1α轴参与了细菌感染PDLFs的促炎反应。【结论】PDLFs是具有MSC特征的主要驻留细胞,可以动态地重新编程其代谢特征以适应细菌感染;此外,琥珀酸的积累、SDH活性的上调和HIF-1α通路的激活可能驱动PDLFs的促炎性反应;因此,调节Succinate-SDH-HIF-1α可能在慢性牙周炎的宿主调节治疗中有前景。