论文部分内容阅读
【背景】肝细胞癌（HCC）是世界范围内癌症相关死亡的第四大原因,且其死亡率逐年增加。目前HCC的治疗方式有手术切除、放疗、化疗和肝移植等,但HCC患者发病多属晚期,使患者治疗策略受限。复发和远处转移是HCC患者预后不良的主要原因。因此,探索HCC发生发展的潜在机制和新的治疗靶点有望改善HCC预后。炎症和免疫逃逸是肿瘤的标志。免疫逃逸通常伴随着免疫抑制细胞的募集,如髓系来源抑制性细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。MDSCs和TAMs通过抑制T细胞免疫功能并促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖和转移发挥促肿瘤作用。HCC是典型的炎症相关肿瘤,具有免疫细胞浸润的特点。但是,目前关于HCC肿瘤微环境中招募这些免疫抑制细胞的机制尚未阐明。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族,可通过与细胞周期蛋白结合后来调节细胞周期和基因转录从而调控细胞增殖、分化、DNA修复和细胞凋亡。最近研究表明,CDK家族的异常调控与不同类型肿瘤的发生和发展相关,这使其成为肿瘤治疗的潜在靶标。其中,CDK9通过与细胞周期蛋白T结合并形成阳性转录延伸因子b（P-TEFb）,在多种生理和病理过程中起着至关重要的作用。P-TEFb能够磷酸化RNA聚合酶II的羧基末端结构域（CTD）上的丝氨酸2位点来调控转录。已有研究证实,CDK9可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,这使得CDK9成为肿瘤调控中的重要靶点。然而关于CDK9在HCC进展和转移中的作用及其机制尚未阐明。【目的】:1.明确CDK家族基因在HCC中的表达情况。2.明确CDK9在HCC中的表达情况及其功能。3.明确免疫抑制细胞MDSCs和TAMs在HCC肿瘤微环境中的表达情况。4.探究CDK9促进HCC进展和转移的机制。5.探索潜在的抑制HCC进展和转移的治疗策略。【方法】:1.采用RT-PCR方法检测CDK家族基因在HCC及其癌旁组织中的表达情况。2.采用RT-PCR和IHC方法分析CDK9在正常肝脏组织、HCC及其癌旁组织中的表达情况。3.通过慢病毒转染方法构建CDK9过表达和下调的稳转细胞系,细胞水平和动物水平检测CDK9在HCC迁移和侵袭中的作用。4.通过趋化因子及其受体PCR芯片筛选出CDK9的下游靶分子,Western blotting实验进行验证。并通过体内实验验证靶基因在CDK9诱导的HCC进展和转移中的作用。5.检测肝脏原位移植瘤模型中MDSCs和TAMs的浸润情况,并通过免疫荧光方法进行验证。6.通过肝脏原位移植瘤模型和免疫荧光方法检测CDK9抑制剂和/或CCR2抑制剂对HCC进展和转移的影响。【结果】:1.RT-PCR结果发现CDK家族基因中CDK1、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDK12、CDK14和CDK20在HCC中的表达水平明显高于癌旁组织,其中CDK9升高相对最显著。2.RT-PCR和IHC染色结果显示CDK9在HCC中的表达水平显著高于癌旁组织。在复发和转移的HCC患者中,CDK9的表达显著高于未复发和未转移的HCC患者。Transwell实验表明上调CDK9促进了HCC细胞的迁移和侵袭能力,而下调CDK9则明显抑制了HCC细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠肝脏原位移植瘤模型中上调CDK9可以促进裸鼠肺脏转移的发生率、缩短裸鼠生存时间,反之,下调CDK9则可降低裸鼠肺脏转移发生率并延长裸鼠生存时间。3.趋化因子及其受体PCR芯片筛选出CDK9过表达后上调最显著的基因CCL2（MCP-1）并通过Western blotting实验进行了验证。然后通过慢病毒转染构建了稳定转染的细胞系Hepa1-6-CDK9和Hepa1-6-CDK9+LV-sh MCP-1,并在动物水平验证了过表达CDK9可以促进Hepa1-6细胞的转移能力,然而敲除MCP-1则可抑制CDK9诱导的Hepa1-6细胞的转移能力。4.Transwell实验证明,用Hepa1-6-CDK9的细胞培养基处理的MDSCs和TAMs的迁移能力增强,然而敲低MCP-1或者使用CCR2的抑制剂RS102895处理后则显著抑制了CDK9过表达所促进的MDSCs和TAMs的迁移能力。动物实验中,CCR2抑制剂处理后抑制了小鼠HCC细胞的转移能力。小鼠肝脏原位肿瘤组织切片的免疫荧光实验也证实CCR2抑制剂处理后降低了MDSCs和TAMs的浸润,提高了CD8+T细胞的数量。5.CDK9抑制剂MC180295和CCR2抑制剂RS102895联合应用可显著抑制小鼠HCC的转移能力,降低了MDSCs和TAMs的浸润,提高了CD8+T细胞的数量。【结论】:本研究明确了CDK9在HCC的表达情况及其促进HCC迁移、侵袭和转移的功能;揭示了CDK9促进HCC转移的分子机制,即CDK9可通过CCL2/CCR2信号通路诱导MDSCs和TAMs的浸润来促进HCC的转移;证实了联合应用CDK9抑制剂MC180295和CCR2抑制剂RS102895可显著抑制小鼠HCC的转移能力。综上,本研究阐明了CDK9促进HCC转移的分子机制,为HCC提供潜在的治疗靶点。