药物靶向传递是包括癌症在内的多种疾病治疗面临的重大挑战,若能在病灶部位靶向富集的基础上,实现药物的时空控释以取得精准治疗则具有重要的创新意义和应用价值。本论文设计并开发一种超声响应型Pluronic P123/F127聚合物胶束(M)携载姜黄素(Cur),通过超声声孔效应触发药物释放,并且综合评估了药物在肿瘤部位选择性富集和位点特异性声化学治疗。结果表明,与游离Cur相比,负载Cur的P123/F127混合胶束(Cur-M)能够提高体内长循环时间并且可以增加肿瘤细胞药物摄取。在聚焦超声的辅助下,Cur-M在静脉给药后以时间依赖性的方式在肿瘤部位靶向富集,这主要是由于超声声孔效应提高了肿瘤区域组织的通透性并增强了 Cur-M在肿瘤细胞的渗透;此外,Cur-M自组装体系可以通过超声不同处理参数来调节,混合胶束的体外药物释放很大程度上取决于超声强度而不取决于超声持续时间,表明超声空化阈值对声化学疗法是十分重要的;在双侧肿瘤模型中通过瘤内给药方式证实了体内位点特异性药物释放和渗透;在体小鼠抑瘤实验表明超声辅助位点特异性化疗能够显著抑制肿瘤生长。综上所述,本研究所建立的超声引导纳米药物靶向富集和局部释放体系可作为一种提高化疗效率的新策略。本论文主要从聚合物胶束的制备、声控释药、体外细胞毒性、声孔效应引导的肿瘤部位药物富集和渗透、体内疗效评价等方面展开研究。具体从以下几个方面概述:第一部分负载姜黄素的聚合物混合胶束(Cur-M)的制备与表征选择Pluronic混合胶束作为包载抗肿瘤药物Cur的药物装载平台,将Cur装载在胶束疏水内核中。采用薄膜水化法制备Cur-M,利用动态光散射法测定混合胶束的粒径和电位;透射电子显微镜观察胶束的形态;紫外分光光度法测定载药胶束的包封率和载药量;同时为了考察胶束在血液循环中的稳定性,配置不同含量的FBS来模拟体内环境对其进行考察。结果显示:采用薄膜水化法制备Cur-M的操作步骤简单、稳定性好;透射电子显微镜观察到胶束呈圆球状、单一分散;动态光散射法测得的胶束粒径大约为23 ±1.06 nm,能够通过渗透滞留效应被动靶向于肿瘤组织;在此系统中,胶束的载药量为4.56%,包封率为86.67%,并且在48小时内保持相对稳定;此外,在不同含量的FBS环境中,胶束溶液在24小时内相对稳定。以上结果表明,胶束化的Cur能够有效地克服Cur在临床应用中生物利用度低等问题。第二部分超声空化效应触发的药物释放首先,采用TA法测定超声空化效应。其次,由于绝大多数荧光分子负载在胶束内部会出现局部浓度过高导致荧光淬灭的现象,采用荧光分光光度计测定了不同处理条件下的药物荧光强度。体外药物释放研究:将等量的Cur-M作为对照组和超声处理组,对照组不做任何处理,超声处理组采用超声频率为1.90 MHz,不同的超声强度(负载功率分别为1W、2 W、3 W)、超声时间、超声次数进行处理。采用透析法测定超声处理后的Cur-M中Cur释放曲线。结果表明:Cur-M的荧光强度明显低于游离Cur,表明Cur成功负载在Cur-M内部;经过超声处理后,Cur-M+Us的荧光强度明显高于Cur-M,预示着超声处理后胶束解体释放出所包载的药物;采用TA法测定超声空化效应,结果发现随着超声强度的增加,空化效应明显增加,提示在本研究中Cur的释放主要归因于超声诱导的空化效应,超声触发的药物释放与超声强度有直接关联。第三部分体外细胞摄取和细胞毒性研究体外试验研究选用人乳腺癌MDA-MB-231细胞为模型,采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察不同处理后细胞药物摄取;利用扫描电子显微镜观察处理24小时后细胞形态变化;通过MTT法检测处理24小时后细胞存活;采用AnnexinV/PI检测处理24小时后细胞凋亡。研究发现:(1)流式细胞仪检测MDA-MB-231细胞内Cur的含量,结果显示Cur-M相对于游离的Cur提升了细胞内药物富集含量,且经过超声处理后更加容易增加细胞内的药物摄取(p<0.01);激光共聚焦显微镜观察结果表明,Cur-M+Us组显示出更强的Cur荧光强度。(2)扫描电镜观察显示,对照组细胞呈现典型的梭形形态,Cur-M+Us组细胞骨架塌陷、形态严重受损。(3)细胞毒性分析显示,Cur和Cur-M的细胞毒性呈剂量依赖性,在所选定的浓度范围内,游离Cur没有明显的细胞毒性,在Cur浓度为10 μM时,Cur-M引起的细胞活性下降大约为10.60%,然而在Us(0.4W/cm2)的存在下,其细胞活性下降到59.57%(p<0.01);AnnexinV/PI 双染结果显示 Cur-M+Us 能够在 MDA-MB-231 细胞中引发明显的细胞凋亡。第四部分超声体内触发的药物富集和渗透首先建立4T1移植瘤小鼠模型考查Cur-M在体内的长循环特性,尾静脉注射相同剂量的Cur和Cur-M,不同时间点测定小鼠血液中、主要器官、肿瘤部位的药物含量。其次建立小鼠背部双侧肿瘤模型作为自体对照,利用近红外染料DiR代替Cur进行活体成像观察超声处理后不同时间点肿瘤部位荧光强度;最后建立小鼠背部双侧肿瘤模型作为自体对照,瘤内注射DiR标记的胶束,活体成像检测超声处理前后肿瘤部位的荧光强度。结果表明:(1)与游离Cur相比,Cur-M在48小时范围内显示出明显的血液滞留时间,注射48小时后,在血液中仍然有超过18.42%的Cur-M存在,而游离的Cur在注射12后在血液中几乎检测不到。同时Cur-M在主要器官中的滞留时间远远大于Cur。(2)药物富集结果显示,尾静脉给药5分钟后,对右侧肿瘤进行Us2超声处理(负载功率为2 W,1.90 MHz,5分钟),活体成像结果显示,左侧肿瘤药物在24小时达到最大富集,而超声处理的右侧肿瘤在12小时达到最大富集,且右侧肿瘤荧光强度远大于左侧对照组。(3)药物渗透和释放结果显示,瘤内注射DiR标记的胶束,对左侧肿瘤进行Us3超声处理(负载功率为3 W,1.90 MHz,3分钟),结果发现超声处理后肿瘤部位的荧光强度明显增加,说明负载在胶束内部的DiR达到释放;同时采用体式荧光显微镜观察肿瘤组织连续冰冻切片结果显示,处理后组织中Cur弥散分布的范围明显扩大。由上述研究结果推测,超声能够促进药物在肿瘤部位的富集和渗透。第五部分体内抗肿瘤疗效研究通过建立4T1移植瘤小鼠模型,分别从肿瘤体积、小鼠体重、主要脏器观察、形态学检测、免疫组化分析等几个方面探讨Cur-M联合超声处理对4T1移植瘤的生长抑制效应。研究结果表明:采用二次超声处理的方式能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长(第一次超声Us2处理5分钟,目的是为了促进药物在肿瘤部位的富集;第二次超声Us3处理3分钟在给药12小时后,目的是为了促进肿瘤部位药物释放和渗透),在所选用剂量和超声参数下,不同处理对小鼠体重和主要脏器无明显影响,提示联合处理具有一定的系统安全性。结论综上所述,本课题成功设计并开发了一种具有超声响应型的新型负载Cur的聚合物胶束并将其应用于声化学疗法研究中。研究发现,混合胶束联合超声具有显著的抗肿瘤活性,超声诱导的空化效应能够显著性增加肿瘤细胞内Cur的积累;同时体内外实验均表明,超声引发的Cur-M药物释放呈超声强度依赖性趋势。聚焦超声处理可以指导混合胶束的原位富集和靶向深入渗透。在尾静脉注射Cur-M后,进行局部位点超声辐照能够显著性抑制肿瘤生长,并且在整个治疗过程中是相对安全可靠的。因此,本研究所开发的治疗平台具有潜在的抗肿瘤优势,有望在未来临床应用发挥重要作用。