论文部分内容阅读
目的探讨泛素链接酶E3核心组分S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase-associated protein1 SKP1)在肝脏内胆管细胞癌组织及相邻的正常胆管组织表达差异。体外实验调控SKP1表达,进一步明确SKP1对肝内胆管细胞(RBE)的增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法收集25例于河南大学人民医院2017年8月至2019年4月接受根治性切除手术的肝脏内胆管细胞癌组织及其相邻2cm左右的正常胆管组织,术中组织离体后经家属过目,采集一定质量标本,装入冻存管中,液氮转运、保存,并做好详细登记。本研究经河南大学人民医院(河南省人民医院)伦理委员会批准,所有患者均签署标本收集知情同意书。培养人肝内胆管细胞癌细胞(RBE)及人胚肾细胞(293T),掌握细胞传代规律。利用基因库,设计构建SKP1表达干扰载体和空白载体,运用慢病毒包装技术,稳定转染入肝内胆管癌细胞中,经抗生素筛选,构成实验组和对照组。蛋白裂解液提取组织蛋白和细胞蛋白,测定蛋白浓度,运用Western-Blot技术检测SKP1临床标本及稳转细胞的表达差异,统计分析,得出结论。当实验组和对照组构建成功后。CCK8测定吸光度计算两组平均相对生存率得出SKP1对RBE的增殖能力影响;划痕实验计数两组细胞穿过基线的平均数目反映SKP1对RBE迁移能力的影响;Transwell小室实验计数穿过小孔并被染上紫色的细胞数目间接反应SKP1对RBE的侵袭能力的影响。最终所有数据均使用SPSS22.0进行统计学方法分析,结果用均数±标准差(Mean±SD)表示,两组间数据用t检验,结果以p<0.05为差异有统计学意义。结果1、临床组织样本中,肝脏内胆管细胞癌组织中SKP1表达为正常胆管组织(1.701±0.215)倍,差异有统计学分析意义(t=8.512 p<0.05)。2、慢病毒转染RBE细胞构建实验组和对照组成功,实验组SKP1表达降低,根据Western-Blot实验测定实验组SKP1表达较空白组降低(3.632±0.335)倍,差异有统计学分析意义(t=11.376 p<0.01)。3、CCK8测得的实验组吸光度(A值)在24小时为0.316L/(g·cm)、48小时为0.524L/(g·cm),72小时为0.527 L/(g·cm)。对照组平均吸光度为24小时0.594 L/(g·cm),48小时为1.228 L/(g·cm),72小时为1.503 L/(g·cm)。实验组较对照组平均相对生存率分别为(53.136±0.314)%、(42.661±0.248)%、(35.037±0.203)%,差异均有统计学分析意义(t分别为8.594 8.899 9.210 p<0.05)。4、划痕实验显示24、48h实验组迁移的细胞平均数目(41.198±3.092)、(64.773±6.437)个较对照组(113.487±3.514)、(168.767±8.151)个明显降低,差异均有统计学分析意义(t分别为5.430 6.224 p<0.05)。5、Transwell实验结果显示实验组穿过小孔细胞平均数目为(34.185±3.124)个较对照组(121.234±6.814)个明显降低,差异有统计学分析意义(t=9.918 p<0.05)。结论1、肝脏内胆管细胞癌组织中SKP1表达高于正常胆管组织;2、降低SKP1表达能够有效地抑制肝内胆管细胞癌的增殖、迁移及侵袭能力。