【摘 要】
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成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是受体酪氨酸激酶超家族的成员,通过与配体FGF结合,调控细胞的增殖、分化和存活,对机体起重要作用,而FGFR的表达及调控异常与多种癌症发生发展
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成纤维细胞生长因子受体(FGFR)是受体酪氨酸激酶超家族的成员,通过与配体FGF结合,调控细胞的增殖、分化和存活,对机体起重要作用,而FGFR的表达及调控异常与多种癌症发生发展有关。为更好研究FGFR作用方式和功能,本研究首次将FKBP-RAPA-FRB系统用于FGFR的调控,构建不受内源配体干扰,能被雷帕霉素(RAPA)特异性激活的化控FGFR。首先在HEK293细胞中转染化控m FGFR1质粒(PCDNA3.1-MYR-m FGFR1(ICD)-FKBP-FLAG以及PCDNA3.1-MYR-m FGFR1(ICD)-FRB-HA),Western blot证实通过共转,细胞内可以同时表达分别含FKBP和FRB的化控m FGFR1蛋白,构成未激活的化控FGFR1系统。针对化控m FGFR1蛋白过表达引起的自动激活,对CMV启动子进行不同方式的剪接,筛选CMV_C作为化控FGFR质粒的启动子来降低表达效率。这也为降低本底提供了除降低转染量外的另一选择。加药实验结果表明,100 n M RAPA本身不影响MAPK/ERK通路,而仅在表达化控FGFR1系统的细胞中能激活此系统,并激活下游ERK。同时检测了RAPA作用浓度和作用时间对系统激活情况影响,选定50 n M作为RAPA作用浓度,作用15 min时下游ERK已被激活。用免疫共沉淀实验证实RAPA介导了化控m FGFR1蛋白的二聚激活。并且RAPA激活化控m FGFR1可被FGFR抑制剂AZD4547抑制。为验证FGFR异源二聚激活可能性,利用基因工程和分子生物学技术,构建了化控h FGFR1和h FGFR2质粒(PCDNA3.1-MYR-h FGFR1(ICD)-FKBP-FLAG,PCDNA3.1-MYR-h FGFR2(ICD)-FKBP-FLAG和PCDNA3.1-MYR-h FGFR1(ICD)-FRB-HA),通过共转,在HEK293细胞中分别表达了化控FGFR1同源二聚系统,以及化控FGFR1和FGFR2异源二聚系统。实验表明RAPA能介导化控FGFR1和FGFR2形成异源二聚体激活,并活化下游ERK通路。活化的化控FGFR同源和异源二聚系统都能招募Grb2。与同源二聚相同,化控FGFR1和FGFR2异源二聚激活能被AZD4547抑制。为探究FGFR同源和异源二聚激活对肿瘤细胞的影响,用胰腺癌细胞Panc1构建了稳定过表达化控h FGFR1系统的Panc1-homo细胞,以及稳定过表达化控h FGFR1和h FGFR2异源二聚系统的Panc1-hetero细胞。通过划痕和Transwell实验,发现FGFR同源和异源二聚激活均能增强胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。
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