【摘 要】
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目的:探讨G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)4对人骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:1.人骨肉瘤U2OS(p53+/+)细胞瞬时转染p EGFP-GRK4质粒,24小时后经流式细胞术分选,U2OS/GRK4(-)、U2OS/GRK4(+)细胞;2.MTT法检测U2OS/GRK4(-)、U2OS/GRK4(+)细胞的增殖情况;3.以p EGFP
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目的:探讨G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinase,GRK）4对人骨肉瘤细胞增殖的影响。方法:1.人骨肉瘤U2OS(p53+/+)细胞瞬时转染p EGFP-GRK4质粒,24小时后经流式细胞术分选,U2OS/GRK4（-）、U2OS/GRK4（+）细胞;2.MTT法检测U2OS/GRK4（-）、U2OS/GRK4（+）细胞的增殖情况;3.以p EGFP-GRK4质粒转染U2OS,24小时后行流式细胞仪检测,先后以FITC通道和PI通道设门圈定U2OS/GRK4（-）、U2OS/GRK4（+）细胞群、分析细胞周期分布情况;4.构建激酶活性缺失的突变体p EGFP-GRK4 K216M/K217M,并分别转染U2OS及Saos-2(p53-/-)细胞,24小时后,流式细胞术检测:先后以FITC通道和PI通道设门圈定并分析U2OS/GRK4 K216M/K217M（-）和U2OS/GRK4 K216M/K217M（+）、Saos-2/GRK4 K216M/K217M（-）和Saos-2/GRK4 K216M/K217M（+）的细胞周期分布情况;5.慢病毒介导GRK4基因表达技术构建高或稳定表达的U2OS细胞（株）,感染U2OS和Saos-2细胞;6.慢病毒介导的GRK4基因,LV5-GRK4（野生型）以及LV5-GRK4 K216M-K217M（突变型）感染U2OS和Saos-2细胞。72小时后收集细胞,细胞分别种于96孔细胞培养板,采用MTT法检测细胞增殖情况,绘制生长曲线图;7.72小时后收集慢病毒感染的细胞,将细胞分别种于放有盖玻片的12孔细胞培养板内,次日做Ki-67免疫荧光染色;8.72小时后收集慢病毒感染的细胞,将细胞分别种于12孔细胞培养板内,于第6日和第9日做衰老相关-β-半乳糖苷酶活性（SA-β-gal）染色;结果:1.流式细胞术分选得到U2OS/GRK4（-）（纯度为98.2%）和U2OS/GRK4（+）（纯度为94.1%）二群细胞;2.MTT的实验结果显示,与U2OS/GRK4（-）组相比,U2OS/GRK4（+）组的细胞增殖受到显著抑制;3.细胞周期结果显示,与U2OS/GRK4（-）相比,U2OS/GRK4（+）细胞阻滞于G1/G0期（分别为47.0±4.8%和83.4±6.7%,p<0.01）;4.在U2OS及Saos-2细胞中,与GRK4 K216M/K217M（-）组相比,GRK4 K216M/K217M（+）组细胞周期均阻滞于G1/G0（U2OS细胞中分别为50.9±10.0%和80.7±13.2%p<0.05,Saos-2细胞中分别为39.8±6.9%和71.7±2.3%p<0.01）;5.慢病毒介导的GRK4基因的过表达感染U2OS和Saos-2细胞,感染率>70%;6.MTT的实验结果显示,U2OS细胞和Saos-2细胞,与NC对照组比较GRK4过表达的野生型和突变型的U2OS和Saos-2细胞增殖显著受到抑制;7.免疫荧光染色结果显示,与NC对照组比较GRK4过表达的野生型和突变型的U2OS和Saos-2细胞的Ki-67阳性细胞数显著降低;8.细胞衰老检测结果表明第六天U2OS/GRK4-Wt和Mut组蓝染率分别为（54.7±7.4%,51.0±17.5%p<0.05）显著高于GRK4-NC对照组（5.0±3.5%p<0.05）,第9天U2OS/GRK4-Wt和Mut组蓝染率分别为（69.7±8.6%,74.7±19.9%p<0.05）显著高于GRK4-NC对照组（7.0±3.5%p<0.05）。结论:GRK4通过p53非依赖信号通路显著抑制人骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞的体外生长,其抑制细胞增殖的生物学作用与其激酶活性无关。这一研究结果为进一步探索GRK4抑制肿瘤细胞增殖的分子机制提供了有价值的信息。
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