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微流控生物被膜催化反应技术可定向转化底物生成目标产物，有望用于天然产物糖基定向改造制备珍稀的药效分子。然而，由于缺乏带荧光标记、催化性能和稳定性好的全细胞催化剂，极大地限制了其应用。本文利用从大象粪便宏基因组筛选出的GH78家族基因rhaB1转入大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)BL21(DE3)异源表达获得的α-L-鼠李糖苷酶(α-L-Rhamnosidase，RhaB1)为研究对象，首次采用截短突变策略构建重组菌株BL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP，实现酶RhaB1-ΔN1和EGFP的融合表达，利用自主设计的分段式微流控技术可控制备产酶菌膜，并用于连续生物催化水解芦丁合成目标产物异槲皮苷。主要研究结果如下：
(1)以α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的结构分析为指导，筛选酶活和稳定性俱佳的截短突变体。结果表明：分子模拟RhaB1具有5个结构域，C端包含2个保守结构域，N1为冗余肽段，预测RhaB1催化位点分别为Asp655与Glu918。围绕RhaB1催化域构建了8个截短突变体，4个具有酶活(RhaB1-ΔN1、RhaB1-ΔN1-dE1、RhaB1-ΔN1-dE2、RhaB1-ΔN1-dE3)，其中RhaB1-ΔN1的酶活最高，其分子量为77.05kDa，酶活为190.55U/mL，比RhaB1提高了12.12%。RhaB1-ΔN1的最适温度为35℃，比RhaB1降低了5℃；在30℃及35℃下处理60min后，剩余相对酶活保持在90.12%以上。RhaB1-ΔN1的最适pH为6.5，在pH6.0-6.5之间剩余相对酶活保持在92.32%以上。以pNPR为底物测试催化性能，RhaB1-ΔN1的Km为1.12mg/mL，比RhaB1降低了47.41%，同时催化效率Kcat/Km提高了7.2倍。因此，RhaB1经N1截短后的突变体RhaB1-ΔN1具有更高的酶活和更强的稳定性。
(2)构建重组E.coliBL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP，制备操作简便、可视化的全细胞催化剂用于催化水解芦丁制备异槲皮苷，并利用表面等离子共振(SPR)分析RhaB1以及RhaB1-ΔN1-EGFP对芦丁的亲和力。结果表明：重组RhaB1-ΔN1-EGFP的最适温度为35℃，在35℃下处理60min后剩余相对酶活为89.24%；最适pH为6.5，35℃下孵育60min，在pH6.0-6.5剩余相对酶活保持在94.15%以上；以pNPR为底物催化水解反应动力学参数Km为1.31mg/mL，比RhaB1下降了38.49%，表明其对底物的亲和力更高。在生物催化水解芦丁制备异槲皮苷的反应时，以RhaB1-ΔN1-EGFP粗酶液为催化剂，最适温度为35℃，最适pH为6.5，在此条件下反应8h获得最大得率93.69±0.39%；以RhaB1-ΔN1-EGFP全细胞为催化剂，最适温度为40℃，最适pH为6.0，在此条件下反应1.5h获得最大得率，为90.78±6.4%，比粗酶液反应时间缩短了81.25%。RhaB1-ΔN1-EGFP和RhaB1与芦丁的平衡解离常数分别为7.05×10-6mol·L-1和2.14×10-6mol·L-1，表明两种酶均能与底物特异性结合。因此，RhaB1-ΔN1-EGFP全细胞催化剂除了具备示踪性能，其催化性能和稳定性更好。
(3)构建微流控重组E.coliBL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP的生物被膜系统，并应用于催化水解芦丁合成异槲皮苷。结果表明：微流控芯片内重组生物被膜的最佳生长条件为：用硅烷修饰芯片后定植菌株，培养方式采用“水-空气”分段流，水相与空气相流速为8μL/min，培养液pH为7.0；对微通道内的生物被膜采用荧光倒置显微镜(Fluorescence inverted microscope, FIM)、傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR )及激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, LSCM)表征，发现生物被膜在微通道表面经硅烷化修饰后的菌株荧光强度提高了74%，在分段流条件下培养48h后呈现紧凑平坦的薄膜特性。将重组菌株定植于微流控芯片通道内表面，通过分段式微流控技术制备生物被膜，以其作为催化剂，当底物芦丁浓度为0.6g/L、温度为35℃、pH为6.5时，异槲皮苷产率可达0.79μg/Ltube/d，相比突变体RhaB1-ΔN1-dE1提高了2.25倍。因此，微流控重组BL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP生物被膜实现了可控的稳定生长，并能够有效地连续转化底物生成目标产物。
综上，本文获得了催化性能和稳定性俱佳的N1域截短的新酶RhaB1-ΔN1，成功构建了E.coliBL21-rhaB1-ΔN1-EGFP全细胞催化剂，并可控制备了微流控生物被膜催化系统有效地连续转化芦丁生成异槲皮苷，为桑树黄酮苷的糖基定向改造提供了新技术。
(1)以α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的结构分析为指导，筛选酶活和稳定性俱佳的截短突变体。结果表明：分子模拟RhaB1具有5个结构域，C端包含2个保守结构域，N1为冗余肽段，预测RhaB1催化位点分别为Asp655与Glu918。围绕RhaB1催化域构建了8个截短突变体，4个具有酶活(RhaB1-ΔN1、RhaB1-ΔN1-dE1、RhaB1-ΔN1-dE2、RhaB1-ΔN1-dE3)，其中RhaB1-ΔN1的酶活最高，其分子量为77.05kDa，酶活为190.55U/mL，比RhaB1提高了12.12%。RhaB1-ΔN1的最适温度为35℃，比RhaB1降低了5℃；在30℃及35℃下处理60min后，剩余相对酶活保持在90.12%以上。RhaB1-ΔN1的最适pH为6.5，在pH6.0-6.5之间剩余相对酶活保持在92.32%以上。以pNPR为底物测试催化性能，RhaB1-ΔN1的Km为1.12mg/mL，比RhaB1降低了47.41%，同时催化效率Kcat/Km提高了7.2倍。因此，RhaB1经N1截短后的突变体RhaB1-ΔN1具有更高的酶活和更强的稳定性。
(2)构建重组E.coliBL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP，制备操作简便、可视化的全细胞催化剂用于催化水解芦丁制备异槲皮苷，并利用表面等离子共振(SPR)分析RhaB1以及RhaB1-ΔN1-EGFP对芦丁的亲和力。结果表明：重组RhaB1-ΔN1-EGFP的最适温度为35℃，在35℃下处理60min后剩余相对酶活为89.24%；最适pH为6.5，35℃下孵育60min，在pH6.0-6.5剩余相对酶活保持在94.15%以上；以pNPR为底物催化水解反应动力学参数Km为1.31mg/mL，比RhaB1下降了38.49%，表明其对底物的亲和力更高。在生物催化水解芦丁制备异槲皮苷的反应时，以RhaB1-ΔN1-EGFP粗酶液为催化剂，最适温度为35℃，最适pH为6.5，在此条件下反应8h获得最大得率93.69±0.39%；以RhaB1-ΔN1-EGFP全细胞为催化剂，最适温度为40℃，最适pH为6.0，在此条件下反应1.5h获得最大得率，为90.78±6.4%，比粗酶液反应时间缩短了81.25%。RhaB1-ΔN1-EGFP和RhaB1与芦丁的平衡解离常数分别为7.05×10-6mol·L-1和2.14×10-6mol·L-1，表明两种酶均能与底物特异性结合。因此，RhaB1-ΔN1-EGFP全细胞催化剂除了具备示踪性能，其催化性能和稳定性更好。
(3)构建微流控重组E.coliBL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP的生物被膜系统，并应用于催化水解芦丁合成异槲皮苷。结果表明：微流控芯片内重组生物被膜的最佳生长条件为：用硅烷修饰芯片后定植菌株，培养方式采用“水-空气”分段流，水相与空气相流速为8μL/min，培养液pH为7.0；对微通道内的生物被膜采用荧光倒置显微镜(Fluorescence inverted microscope, FIM)、傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer, FTIR )及激光共聚焦扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope, LSCM)表征，发现生物被膜在微通道表面经硅烷化修饰后的菌株荧光强度提高了74%，在分段流条件下培养48h后呈现紧凑平坦的薄膜特性。将重组菌株定植于微流控芯片通道内表面，通过分段式微流控技术制备生物被膜，以其作为催化剂，当底物芦丁浓度为0.6g/L、温度为35℃、pH为6.5时，异槲皮苷产率可达0.79μg/Ltube/d，相比突变体RhaB1-ΔN1-dE1提高了2.25倍。因此，微流控重组BL21-pET-28-rhaB1-ΔN1-EGFP生物被膜实现了可控的稳定生长，并能够有效地连续转化底物生成目标产物。
综上，本文获得了催化性能和稳定性俱佳的N1域截短的新酶RhaB1-ΔN1，成功构建了E.coliBL21-rhaB1-ΔN1-EGFP全细胞催化剂，并可控制备了微流控生物被膜催化系统有效地连续转化芦丁生成异槲皮苷，为桑树黄酮苷的糖基定向改造提供了新技术。