【摘 要】
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研究背景:肿瘤细胞的代谢方式与正常细胞有较大的不同,尤其在糖代谢方面。肿瘤细胞内多种糖代谢酶的表达差异,使肿瘤细胞具有较高的代谢能力。3-磷酸甘油醛-脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）是我们在肿瘤组织与癌旁组织的临床样本中用2D-DIGE结合质谱技术筛选出的差异蛋白。前期的相关研究发现,肿瘤组织的GAPDH表达显著高于癌旁组织,s
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研究背景:肿瘤细胞的代谢方式与正常细胞有较大的不同,尤其在糖代谢方面。肿瘤细胞内多种糖代谢酶的表达差异,使肿瘤细胞具有较高的代谢能力。3-磷酸甘油醛-脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）是我们在肿瘤组织与癌旁组织的临床样本中用2D-DIGE结合质谱技术筛选出的差异蛋白。前期的相关研究发现,肿瘤组织的GAPDH表达显著高于癌旁组织,sh RNA诱导GAPDH表达沉默在稳定转染细胞株NCI-H520细胞及裸鼠中,肿瘤细胞的增殖能力明显降低,并促进了顺铂诱导的NCI-H520细胞凋亡。同时文献中的相关研究表明,GAPDH过度表达可增加Akt的磷酸化,从而增加细胞内Bcl-xl的含量,以避免肿瘤细胞的凋亡。KA（Koningic acid,康宁酸）是一种来源于真菌的小分子化学物质,可对细胞内的GAPDH特异性抑制。研究目的:本实验预研究通过KA抑制GAPDH的方法,探讨其与化疗药物卡铂（CBP）联合应用对体外非小细胞肺癌细胞是否有协同作用,并初步探究KA抑制GAPDH对细胞凋亡的影响,及其诱导细胞凋亡的机制。方法:1.通过CCK-8实验测定在不同KA浓度下,肺鳞癌细胞NCI-H520、肺腺癌A549、肺大细胞癌NCI-H460、永生化支气管上皮细胞HBE等4种细胞的细胞存活率,绘制细胞存活曲线。2.利用CCK-8实验测定不同卡铂（CBP）浓度下,上述4种细胞的存活率,绘制细胞存活曲线。3.利用hoechst33342/pi荧光染色法,探究KA诱导NCI-H520、A549细胞死亡的方式（坏死/凋亡）4.NCIH520和A549细胞为对象,在不同CBP浓度下,探究KA对化疗药物CBP的协同作用;并以HBE为对照,探究KA+CBP对正常细胞影响,以估测二者联合应用的不良反应。5.利用Western bloting方法检测A549和NCI-H520,以及在KA的IC50浓度作用下,A549和NCI-H520中相关凋亡蛋白的变化,如Akt、Bcl-2、Bcl-xl 和 Caspase-3 等。结果:1.CCK-8结果显示4种细胞对KA的敏感性高低为:NCIH460>A549>NCI-H520>HBE。2.CCK-8结果显示4种细胞对CBP的敏感度高低为:HBE>NCI-H520>A549>NCI-H460。3.KA诱导NCI-H520、A549细胞死亡的方式为细胞凋亡。4.联合用药实验显示,KA对CBP抑制NCI-H520、A549、NCI-H460的生存具有协同作用,对正常细胞HBE影响较小。5.Western bloting方法检测结果发现,与HBE细胞相比,KA诱导下的肺癌细胞中的Akt含量升高（p<0.05）,p-Akt含量下降（p<0.05）,Fox O1含量上升（p<0.05）;Bcl-2和Bcl-xl含量均下降（p<0.05）;Caspase3含量下降（p<0.05）,Phospho-Caspase3含量升高（p<0.05）。结论:1.体外实验结果表明,KA较常见临床化疗药物CBP具有更好的抑制肿瘤细胞生存作用。2.KA对CBP抑制肿瘤生存有协同作用,并减小对正常细胞的影响。3.在A549和NCI-H520中,KA特异性抑制GAPDH表达,可下调Akt的磷酸化程度,进而导致Bcl-2和Bcl-xl的下调,从而诱导细胞的凋亡,同时也可促进Caspase3的表达从而诱导细胞的凋亡。
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