目的：卵巢上皮性癌（简称卵巢癌）是卵巢恶性肿瘤中最常见的一种，顺铂作为一线化疗药物在卵巢癌治疗中应用广泛，然而顺铂耐药是卵巢癌术后复发和预后不良的重要因素之一，改善顺铂的化疗效果一直是临床的迫切需求。自噬在清除细胞内受损、变性、衰老或失去功能的蛋白质及细胞器，维持细胞自我稳态方面有重要作用。有研究表明自噬活性的变化与恶性肿瘤的发生发展和肿瘤耐药密切相关。自噬在抗肿瘤治疗中的作用还存在争议。Beclin1基因是第一个确认的哺乳动物的自噬基因，被认为是参与哺乳动物自噬体形成的关键因子。微管结合蛋白1轻链3（Microtubule-associated protein1light chain3,MAP1LC3,LC3）是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3-I，后者经泛素样加工修饰，与自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺结合，称为LC3-II，LC3-II是唯一能可靠关联自噬体的蛋白标记物。LC3现已作为自噬体的特异性标记蛋白, LC3-Ⅱ的含量及与LC3-I的比例可表明自噬体的数量和自噬发生的程度。本实验应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）抑制自噬，观察顺铂对卵巢癌SKOV3及SKOV3耐药株（SKOV3/DDP）细胞增殖和凋亡的变化以及自噬蛋白表达的变化，探讨自噬与卵巢癌细胞顺铂敏感性的关系。方法：1培养卵巢癌细胞株SKOV3和SKOV3/DDP；2应用电子显微镜观察SKOV3和SKOV3/DDP细胞经固定处理后的自噬小体形成情况；3应用MTT方法检测，加入不同浓度的顺铂（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），培养48小时，分别检测对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率，计算顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。4应用MTT方法检测，加入不同浓度的3-MA （0mmol/L、1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L），培养48小时，分别检测对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率，选择3-MA对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的无毒剂量（即对细胞增殖抑制率小于10%的药物浓度，IC10）。5应用MTT方法检测，应用无毒剂量的3-MA联合不同浓度的顺铂（0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml），培养48小时，分别检测对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率，计算顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)。6将SKOV3和SKOV3/DDP细胞分别分为对照组、顺铂处理组、3-MA处理组、3-MA+顺铂处理组，应用流式细胞术检测经过不同处理后SKOV3和SKOV3/DDP细胞的凋亡率；7应用Western blot法检测经过不同处理后SKOV3和SKOV3/DDP细胞的LC3蛋白和Beclin1蛋白的表达水平；8统计方法：数据统计采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，方差齐性检验，三组以上比较采用方差分析，组间差异采用LSD法，两组数据比较采用t检验，以P<0.05时作为有统计学差异的标准。结果：1应用电子显微镜观察到SKOV3/DDP细胞内有多个自噬体形成，表现为线粒体、内质网等细胞器或部分细胞质包裹于双层或多层膜结构中，而SKOV3细胞内可见少量自噬体形成。2MTT法测定不同浓度顺铂作用SKOV3和SKOV3/DDP细胞后得到半数抑制浓度即IC₅₀值，SKOV3细胞IC₅₀为4.47±0.08μg/ml，SKOV3/DDP细胞IC₅₀为17.71±0.15μg/ml；SKOV3/DDP细胞的IC₅₀值明显高于SKOV3细胞的IC₅₀值，其差异有统计学意义（P<0.05）。3MTT法测定3-MA对SKOV3和SKOV3/DDP细胞生长均有抑制作用，且随浓度增加，增殖抑制率相应上升，该作用与3-MA浓度呈依赖关系。3-MA对SKOV3细胞的IC10为2.16mmol/L，对SKOV3/DDP细胞的IC10为2.95mmol/L，因此选择2mmol/L进行后续实验。4MTT法检测3-MA对SKOV3和SKOV3/DDP细胞顺铂敏感性的影响：与单独应用顺铂时相比，3-MA与顺铂联合应用时顺铂对SKOV3/DDP细胞的增殖抑制作用明显增强（P<0.05），IC₅₀为8.85±0.11μg/ml；而对SKOV3细胞的增殖抑制作用无明显增强，IC₅₀为4.31±0.12μg/ml。5流式细胞仪检测结果显示：3-MA对SKOV3和SKOV3/DDP细胞的凋亡无明显影响（P>0.05）；与单独应用顺铂时相比，3-MA与顺铂联合应用时SKOV3/DDP细胞的凋亡率显著增加（P<0.05），SKOV3细胞的凋亡率无明显增加（P>0.05）。6Western blotting结果显示：SKOV3/DDP细胞的LC3蛋白表达水平和Beclin1蛋白较SKOV3细胞明显增多（P<0.05）。3-MA作用后SKOV3和SKOV3/DDP细胞LC3蛋白表达水平和Beclin1蛋白明显降低（P>0.05）；顺铂单独作用时，SKOV3/DDP细胞LC3蛋白表达水平和Beclin1蛋白明显增高（P<0.05），3-MA与顺铂联合应用时SKOV3/DDP细胞LC3蛋白表达水平和Beclin1蛋白较单用顺铂时明显降低（P<0.05）。结论：1SKOV3/DDP细胞的顺铂IC₅₀值显著高于SKOV3细胞的顺铂IC₅₀值（P<0.05），SKOV3/DDP细胞的自噬活性显著高于SKOV3细胞（P<0.05），提示卵巢癌顺铂耐药性的形成可能与自噬增高有关。2顺铂处理后，SKOV3/DDP细胞自噬活性显著增高（P<0.05），SKOV3/DDP细胞的凋亡率显著低于SKOV3细胞（P<0.05），提示顺铂诱导产生的自噬可能与SKOV3/DDP细胞在顺铂作用下凋亡率低有关。3自噬抑制剂3-MA联合顺铂后，可以提高SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性，增加细胞的凋亡率，SKOV3细胞未见明显改变，提示抑制自噬可以部分逆转卵巢癌耐药细胞的顺铂耐药。