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维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)是一种重要的水产病原菌,对水产养殖业造成巨大经济损失,因此研制水产疫苗是必需的,由于其接种受限因素较多,开发新型口服疫苗并选择合适抗原对水产疫苗的研制具有重要意义,麦芽糖孔蛋白作为一种特殊的外膜蛋白进行特异性结合,从而诱导机体释放细胞因子,因此可以作为候选抗原应用于基因口服疫苗的研究。 本试验通过克隆A.veronii TH0426株Malt基因,并构建原核表达系统和细胞表面表达型重组干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Lc-MCS-Malt和分泌表达型Lc-pPG-Malt,通过Western blotting验证蛋白表达。结果显示:经过PCR能扩增得到1314 bp Malt基因片段,Western blotting 条带清晰,蛋白大小45 kDa;通过荧光显微镜可见明显荧光信号的是Lc-MCS-Malt。 为评估重组 L.casei 的免疫保护效果,本试验以鲫鱼作为试验动物,将重组L.casei经过乳糖诱导后混合海藻酸钠包被颗粒饲料投喂鲫鱼,在免疫前0 d、免疫后7、16、25和34 d采组织和血液,检测免疫相关指标;检测重组L.casei定植情况,单独设定试验组,连续投喂7 d,空腹28 d后无菌采集前、中和后肠,利用抗性平板进行计数;攻毒检测免疫保护率。采用ELISA方法检测血清中IgM、ACP、AKP、SOD、IL-10、IL-1β、TNF-α、IFN-γ指标。结果表明:各项指标经过口服免疫后都有所提升并差异明显,通过口服免疫方式鲫鱼能够诱导鲫鱼体液免疫分泌 IgM 和各项免疫指标;同时白细胞吞噬活性与分化能力都有所加强;利用qRT-PCR检测各组织IL-10、IL-1β、TNF-α和IFN-γ细胞因子的转录水平,结果表明:重组 L.casei 通过定植肠道刺激黏膜,使细胞因子的转录水平呈上调趋势,从而提升鲫鱼免疫力,定植情况也表明经过28 d的空腹,肠道内仍存在重组L.casei,表明其定植能力良好;攻毒后观察28 d,发现重组L.casei能有效缓解A.veronii造成的急性感染,在一定程度上起到保护作用。 综上所述,本试验成功构建2种不同表达类型的重组L.casei,Lc-MCS-Malt和Lc-pPG-Malt,经过口服免疫的方式可诱导机体产生体液免疫应答,IgM含量上调并影响相关酶活性,同时促进白细胞分化和加强其吞噬活性,增强机体体液免疫应答,各组织细胞因子的转录水平也呈上调趋势,重组 L.casei 能有效保护鲫鱼并提高机体免疫力,试验结果为水产口服乳酸菌疫苗的研制提供理论基础。