论文部分内容阅读
目的1、了解宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染状况,探究高危型人乳头瘤病毒(high risk-HPV,HR-HPV)感染与宫颈细胞病理学特征之间的关系。2、利用人乳头瘤病毒58突变型E6E7(Mutant type E6E7,m E6E7)融合基因为靶点,以对人无致病性的巨细胞病毒株(Towne株)细菌人工染色体(SW102Towne bacterial artificial chromosome,SW102-T-BAC)为载体,构建携带HPV58m E6E7融合基因的重组病毒,鉴定HPV58m E6E7转化活性,为HPV58型治疗性疫苗研究奠定基础。方法1、收集体检普查女性宫颈脱落细胞,以所提DNA为模板,用HPV L1区通用引物MY09/11,进行PCR扩增,检测宫颈脱落细胞总感染率;利用HPV E6型特异性引物检测宫颈脱落细胞中具体感染型别;统计分析HPV感染与临床病理特征的关系。2、PCR扩增带有50bp Towne开放读码框(open reading frame,ORF)75左右同源臂的Galk、HPV58 E6E7融合基因,采用凝胶回收试剂盒对目的基因片段切胶、回收并纯化。将Galk片段电转至SW102-T-BAC感受态细胞内,使其发生同源重组,通过含有Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得带有Galk的SW102-T-ORF75-GalkBAC克隆,制备其感受态细胞;然后分别将纯化的m E6E7和w E6E7融合基因,电转到SW102-T-ORF75-Galk-BAC感受态细胞,通过脱Galk及氯霉素抗性培养基筛选,获得SW102-T-ORF75-HPV58-m E6E7-BAC及SW102-T-ORF75-HPV58-w E6E7-BAC克隆。提取所得克隆质粒DNA,转染到ARPE-19细胞,逆转录PCR及测序分析验证转染细胞HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7表达状况;观察重组病毒T-ORF75-HPV58-m E6E7及T-ORF75-HPV58-w E6E7对转染ARPE-19细胞的影响,通过软琼脂克隆分析HPV58-m E6E7及HPV58-w E6E7转化活性。结果1、经PCR扩增,检测到573例标本有HPV感染,HPV总感染率为56.85%。HPV16型的感染率为7.33%;HPV18型的感染率为2.62%;HPV58型的感染率为13.61%。依据年龄进行分组,各年龄段中41～50岁组HPV感染率较高为63.66%。对各年龄组HPV感染状况进行统计学分析显示,其差异具有统计学意义(P<0.05)。根据细胞病理学分期结果,HPV在HSIL组、LSIL组、ASC组、NILM组的阳性率分别是100%、80.15%、51.69%、51.55%,随着病变程度的降低HPV感染率呈现下降的趋势,统计分析其差异具有统计学意义(P<0.05)。且HPV58型在HSIL组的感染率较高为12.50%。2、获得了SW102-Towne-ORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-ORF75-w E6E7-BAC的克隆。逆转录PCR及测序分析验证转染细胞中m E6E7及w E6E7的表达正确。转染SW102-T-ORF75-w E6E7-BAC的细胞生长失去接触抑制,因此出现重叠生长现象,其形态特征出现显著变化,由原来的梭形逐渐转变为圆形,肿胀,伴随着胞浆颗粒增多,并且在软琼脂中能够形成克隆;而转染SW102-TowneORF75-m E6E7-BAC及SW102-Towne-BAC及未转染细胞没有出现上述细胞的特点。结论1、所收集标本中HPV总感染率为56.85%,其中所检测型别中HPV58型感染率较高为13.61%。在体检普查41-50岁年龄组感染率较高为63.66%,并且随着宫颈病变严重程度的加重HPV总感染率呈现增高的趋势。因此有必要进行HPV治疗性疫苗的研究。2、获得了T-ORF75-HPV58-m E6E7和T-ORF75-HPV58-w E6E7重组病毒,并且T-ORF75-HPV58-m E6E7转化活性已经消除,为HPV58型治疗性疫苗的研究奠定了基础。图[14]幅;表[5]个;参[86]篇。