论文部分内容阅读
白血病（Leukemia）是儿童时期最常见的恶性肿瘤性疾病,约占儿童肿瘤的35%,其中约95%为急性白血病,慢性白血病只占3%-5%。近十多年来,随着联合化疗的应用,其治疗效果显著提高,但是仍有25%30%的患者复发,而细胞耐药是导致复发的最主要的原因之一。因此寻找新类型的化疗靶向药物成了目前肿瘤治疗研究的热点之一。RITA（Reactivation of P53 and induction of tumor cell apoptosis）是近年来新发现的一种人工合成的小分子化合物。RITA能阻止P53与MDM2结合,激活细胞内P53蛋白,维持其功能状态,从而诱导肿瘤细胞的凋亡,因此可能成为肿瘤治疗的新药物。RITA具有无过敏现象、无抗体产生、不能被机体现有的耐药蛋白泵出细胞等特点,与其他化疗药物一起使用具有协同效应,并且可以增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。因此,RITA作为新型的化疗药物,可能在临床中具有广阔的应用前景。RITA作为一种分子类药物,通过调控肿瘤细胞内多种信号通路,在肿瘤细胞的增殖、凋亡、衰老等过程发挥重要作用。目前研究发现RITA能诱导结肠癌、神经母细胞瘤和胃癌等肿瘤凋亡。但在白血病中的报道研究很少,尤其在国内尚未有研究报道。因此,RITA在白血病细胞中的功能如何,具体的调控机制尚不清楚。本课题研究了RITA诱导白血病细胞发生凋亡的功能,并对其机制进行了探讨,结果简述如下:（1）RITA可以抑制白血病细胞的生长活性。为了研究RITA处理白血病细胞后细胞活性的情况,本研究通过CCK-8计数法观察RITA处理前后细胞的活性情况,结果显示:1、在野生型P53的白血病细胞系（NALM6和Molt4）中,存活的细胞数量显著减少,48h即可观察到细胞生长活性明显受抑制。但不同细胞系中抑制生长活性的程度具有一定差异,NALM6细胞的IC50浓度为0.73μmol/L,Molt4细胞的IC50浓度为1.81μmol/L;2、在突变型P53的白血病细胞系——Reh和CCRF/CEM中,两个细胞系生长活性同样受到抑制,但IC50浓度相对升高,约是野生型P53的白血病细胞的23倍;3、以HL-60细胞为代表的缺失型P53的白血病细胞,抑制效果不明显,IC50浓度是野生型P53的白血病细胞的1027倍,是突变型P53的白血病细胞的38倍,作用时间相对延长。这一结果提示无论是在野生型P53、突变型或缺失型P53的白血病细胞中,RITA均能抑制其细胞的生长,对野生型P53的白血病细胞有明显的杀伤作用,而对缺失型和突变型P53的白血病细胞明显减弱。（2）RITA能诱导白血病细胞凋亡。为了验证RITA能诱导白血病细胞发生凋亡,本研究通过流式细胞术检测RITA处理前后白血病细胞的凋亡情况,并采用western blot法检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示RITA处理后,无论是在野生型P53还是突变型P53的白血病细胞中,肿瘤细胞均发生凋亡,细胞凋亡率随着时间增加而升高。western blot结果可见凋亡蛋白Caspase-3和PARP的表达,证实了肿瘤细胞确实发生凋亡。这一结果提示RITA具有诱导白血病细胞凋亡的功能。（3）RITA通过P53蛋白诱导野生型P53的白血病细胞凋亡。为了明确RITA在野生型P53的白血病细胞的调控机制,本研究首先通过western blot法检测RITA处理前后白血病细胞系中P53蛋白的表达水平。结果显示P53蛋白表达水平随着时间增加而升高。进一步通过荧光定量PCR法验证P53蛋白诱导凋亡的相关通路的基因表达水平,结果发现P53蛋白下游基因MCL-1、C-MYC、4E-BP1基因表达下调,P21基因的表达上调。以上结果提示RITA靶向激活P53蛋白,使其不断聚集及活化,从而调节下游通路基因的表达,通过依赖P53蛋白途径诱导野生型P53的白血病细胞发生凋亡。（4）RITA通过非依赖P53蛋白途径诱导突变型P53的白血病细胞凋亡。为了研究RITA是否通过P53蛋白途径诱导突变型P53白血病细胞凋亡,通过western blot法检测RITA处理前后P53蛋白的变化情况,结果并未见P53蛋白在突变型P53的白血病细胞中表达,提示在突变型P53的白血病细胞中,RITA通过非依赖P53蛋白途径诱导白血病细胞凋亡。由于DNA损伤修复是导致细胞凋亡的重要机制之一,而毛细血管扩张性共济失调症突变基因（Ataxia telangiectasia mutated,ATM）是此通路中重要基因之一。ATM的激活介导了细胞内凋亡信号通路的激活,从而抑制了抗凋亡基因MCL-1的表达。本课题通过荧光定量PCR检测RITA处理前后ATM和MCL-1基因的表达水平,初步探讨RITA是否可以通过DNA损伤修复的途径诱导突变型P53的白血病细胞凋亡,结果显示RITA上调ATM的表达,抑制了MCL-1的表达。以上结果提示RITA可能通过上调ATM激活DNA损伤修复通路诱导突变型P53的白血病细胞发生凋亡。本文主要研究RITA在不同类型白血病细胞系中的功能和具体调控机制,证明RITA通过靶向激活P53,调节线粒体凋亡通路,诱导野生型P53的白血病细胞发生凋亡。本研究首次发现RITA不但诱导野生型P53的白血病细胞凋亡,还可以通过非依赖P53蛋白的途径诱导突变型P53及缺失型P53的白血病细胞凋亡,本课题通过探讨RITA在白血病细胞中的功能及其作用机制,为急性白血病的治疗引入新型化疗靶向药物提供理论依据,具有积极且重要的临床价值。