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研究背景创面愈合包括表皮细胞迁移,增殖与分化,其中表皮细胞向创面中心定向迁移是创面愈合的关键步骤。近年来发现,表皮细胞是以融合的单层朝向创面中心迁移以加速创面愈合进程。表皮细胞片层向创面中心定向迁移的能力受损会导致慢性创面的形成。为了使表皮细胞片层更有效的向伤口中心迁移,我们需要明确指导细胞定向迁移的信号。创面内源性电场作为一个重要的方向信号指导表皮细胞片层有效地向创面中心进行迁移。创面内源性电场是由表皮屏障受损,跨上皮电势差消失后自发产生的,创面中心相对于创缘电势更低,成为内源性电场的负极,而创缘成为该电场的正极。在体外,电场强度为42-200 mV/mm的直流电场可诱导细胞朝正极或负极集体定向迁移,这种现象称为电趋性。有效的电趋性总是伴随着细胞极化的产生,而肌动蛋白丝(F-actin)在迁移细胞片层前缘形成的膜突起是定向迁移的主要驱动力。研究表明电场是诱导细胞极化和表皮细胞定向迁移的重要信号,然而电场指导表皮细胞集体定向迁移的分子机制尚未完全阐明。我们前期的研究表明ADAM17(解聚素金属蛋白酶17)是伤口愈合中的关键调节子:它为表皮细胞迁移建立了最初的起源,并因此激活HB-EGF/EGFR信号通路,这有助于加速创面再上皮化。在损伤的表皮中,激活ADAM17促使HB-EGF分子裂解释放,使EGFR磷酸化水平增强,促进表皮细胞迁移,此信号机制参与表皮屏障修复的调控过程。在电趋性的细胞中,EGFR被认为是调节表皮细胞电趋性迁移中一个重要的受体分子。电场以配体非依赖的方式激活EGFR,随后抑制EGFR的活性显著抑制了表皮细胞的电趋性。此外,在表皮细胞中,电场诱导EGFR和F-actin呈现出共定位且极性分布状态,且HB-EGF/EGFR通路参与F-actin极化的调控。然而ADAM17是否协助HB-EGF/EGFR信号通路在电场作用条件下诱导表皮细胞集体定向迁移,这一信号机制是否又参与电场诱导F-actin的极性分布目前依然未明确。因此本研究将根据这一思路探究ADAM17在电场调节表皮细胞集体定向迁移中的作用与机制。本研究提出“电场通过激活ADAM17,加速HB-EGF分子释放以促进EGFR磷酸化,进而调控表皮细胞的集体定向迁移,进而这一信号通路在电场诱导细胞骨架的极性分布中也发挥着重要作用”的科学假设,并通过一系列实验予以证明,研究对深入揭示ADAM17参与创面表皮细胞定向迁移的作用机制,深化对创面愈合临床治疗的探索,具有重要意义。研究内容与方法1.电场对表皮细胞集体定向迁移的影响使用外加电场诱导表皮细胞趋电性的实验模型,观察表皮单层的电趋性以及与单个细胞在不同电场强度下的电趋性。分析电场对表皮细胞单层电趋性迁移的特征以及表皮单个细胞和细胞片层电趋性迁移的差异。2.ADAM17在电场诱导表皮细胞集体定向迁移中的作用采用ADAM17活性测试试剂盒测试不同电场强度下表皮细胞片层ADAM17活性变化,免疫荧光观察电场对移行前沿表皮细胞ADAM17分布的影响;在此基础上,采用活细胞工作站观察抑制ADAM17活性或干扰ADAM17表达(ADAM17特异性抑制剂TAPI-2预处理或ADAM17-siRNA转染表皮细胞)对表皮细胞片层电趋性迁移的影响,明确ADAM17在表皮细胞片层电趋性迁移中的作用。3.ADAM17调控电场诱导的表皮细胞集体定向迁移的信号机制观察电场作用条件下表皮细胞单层HB-EGF释放、EGFR磷酸化以及EGFR分布的变化;明确抑制ADAM17活性或抑制EGFR磷酸化(EGFR特异性抑制剂AG1478)对表皮细胞片层HB-EGF释放、EGFR磷酸化与分布,以及细胞电趋性迁移的影响;观察外源性重组HB-EGF对ADAM17-si RNA预处理表皮细胞片层EGFR磷酸化和电趋性的影响,揭示HB-EGF/EGFR信号通路在ADAM17调节表皮细胞单层电趋性迁移中的作用。4.ADAM17/HB-EGF/EGFR信号通路对电场诱导F-actin极性分布的影响采用免疫荧光方法,观察电场作用条件下移行前沿表皮细胞F-actin分布的变化;在此基础上,明确干扰ADAM17表达或抑制EGFR磷酸化对电场诱导移行前沿细胞F-actin分布变化的影响。观察外源性补充重组HB-EGF对ADAM17-si RNA预处理表皮细胞片层F-actin极性变化,揭示ADAM17/HB-EGF/EGFR信号通路在电场诱导细胞骨架F-actin极性分布中的重要作用。结果1.电场促进表皮细胞单层朝向电场正极方向定向迁移,且迁移的方向性和速度呈电场强度依赖性。与单个表皮细胞相比,表皮细胞单层呈现出更高效的电趋性响应特征。2.电场促进ADAM17以电场强度依赖的方式活化,且诱导ADAM17聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,呈现极性分布特征。抑制ADAM17活性或沉默ADAM17表达均显著抑制了表皮细胞单层的电趋性特征。3.在电场作用条件下,表皮细胞单层HB-EGF释放增加、EGFR磷酸化增强且聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,也即EGFR呈现极性分布特征。抑制ADAM17活性或沉默ADAM17表达可显著抑制电场诱导的HB-EGF释放、EGFR磷酸化及其极性分布。抑制EGFR显著抑制表皮细胞片层的电趋性迁移。外源性补充重组HB-EGF可逆转ADAM17沉默导致的EGFR磷酸化以及表皮细胞片层电趋性受抑。4.电场诱导F-actin聚集于朝向正极的移行前沿表皮细胞的伪足部分,也即电场作用条件下F-actin发生极性分布,这一极性分布现象可被ADAM17-siRNA和EGFR抑制剂所抑制。外源性补充重组HB-EGF可逆转ADAM17-siRNA对F-actin分布的影响,使F-actin又呈现出极性分布特征。结论综上所述,我们的研究表明,电场是诱导表皮细胞片层集体定向迁移的重要因素。ADAM17活化并极性分布于移行前沿细胞伪足,上调局部HB-EGF/EGER信号,进而诱发细胞微丝骨架F-actin极性重排,是电场诱导表皮细胞集体定向迁移的重要机制。研究为促进创面愈合提供了新的调控靶点。