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研究背景及存在的科学问题蜕皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E)在昆虫蜕皮和变态中起主导作用。过去认为20E直接进入细胞启动基因转录,即基因组途径。近年的研究中发现细胞膜上存在响应蜕皮激素的G蛋白偶联受体(ErGPCRs),它们能介导20E引发的细胞内Ca2+浓度的迅速升高,进而活化蛋白激酶C (PKC)信号转导途径,即非基因组途径。胞内Ca2+浓度升高后需要与胞内多种钙结合蛋白形成复合物来发挥作用,如钙调蛋白(calmodulin, CaM)。CaM可以结合4个Ca2+形成Ca2+/CaM活性复合物,进而结合钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ),使CaMKⅡ发生白磷酸修饰而活化。活化后的CaMKⅡ在细胞核内可以磷酸化转录因子或其他蛋白,从而调节基因转录。但CaMKⅡ在20E调控的Ca2+信号途径中的功能及作用机理尚不清楚。果蝇中的研究还发现细胞膜上的多巴胺/蜕皮激素受体(DmDopEcR)可以和20E结合并可以介导胞内cAMP浓度升高；蜕皮激素在30 s内诱导家蚕前丝腺细胞内cAMP浓度升高,表明20E可能诱导cAMP介导的非基因组信号途径。cAMP与依赖cAMP的蛋白激酶A (PKA)调节亚基(PKAR)结合,使其与催化亚基(PKAC)分离,进入细胞核,使环磷腺苷应答元件结合蛋白(CREB)磷酸化并结合到环磷腺苷应答元件(CRE)上,调控基因表达,即PKA信号转导通路。然而20E激发的cAMP信号转导途径及其在调节昆虫变态发育中的作用及机理并不清楚。本论文用鳞翅目昆虫棉铃虫作为实验材料,并利用棉铃虫表皮细胞系(HaEpi)平台,研究了CaMKⅡ在20E调控的Ca2+信号途径中的功能及作用机理、PKAC在20E调控的昆虫变态发育中的作用及机理。研究结果1.20E诱导CaMKⅡ磷酸化进而通过调节细胞核内EcRBl/USP1转录异源二聚体的形成来调控基因的启动。在棉铃虫蜕皮期和变态期CaMKⅡ表达量升高。在虫体中通过RNA干扰技术(RNAi)沉默CaMKⅡ导致20E诱导基因表达量下降,进而导致棉铃虫不能顺利完成变态。在HaEpi细胞系中,20E快速诱导CaMKⅡ第290位苏氨酸发生磷酸化,并使CaMKⅡ进入细胞核。GPCR抑制剂Suramin、磷脂酶C (PLC)抑制剂U73122以及1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)抑制剂光溜海绵素(Xestospongin C, XeC)对20E诱导的细胞内Ca2+浓度升高及CaMKⅡ磷酸化有显著抑制作用。在细胞内沉默ErGPCRl、 ErGPCR2以及G蛋白alpha q (Gaq)也能抑制20E诱导的CaMKⅡ磷酸化。细胞核内的CaMKⅡ介导去乙酰化酶3(HDAC3)的磷酸化并出核,维持转录因子USP1第303位赖氨酸乙酰化,使其与EcRB1形成转录异源二聚体,并与蜕皮激素响应元件(EcRE)结合。以上结果说明,20E通过ErGPCRs-、Gαq-，PLC-介导Ca2+信号转导途径凋控CaMKⅡ磷酸化和核移位,进而调节USP1赖氨酸乙酰化并形成EcRB1/USP1异源二聚体,最终调控基因组途径的启动。2.20E引发细胞内PKA信号转导途径磷酸化CREB上调基因组转录途径。在棉铃虫幼虫通过RNAi沉默PKA催化亚基1(PKAC1),导致幼虫不能顺利完成化蛹,并且20E诱导基因的表达量下降。GPCR抑制剂Suramin、cAMP生成抑制剂盐酸布比卡因、以及沉默ErGPCR2都能抑制20E介导的PKAC1的磷酸化。PKAC1在细胞核内直接磷酸化CREB的第143位丝氨酸残基。20E可以诱导含有CRE及EcRE核心元件的pHR3-P-IE1-RFP-His质粒表达红色荧光蛋白。GPCR抑制剂Surami、PKA抑制剂H89、以及沉默ErGPCR1和ErGPCR2都能抑制20E对该RFP的上调表达。缺失质粒中的CRE后,20E诱导RFP表达的能力下降。20E诱导CREB磷酸化并结合到CRE上,沉默PKAC1后CREB不能磷酸化因而不能结合到CRE上。这些结果说明,20E通过ErGPCR2介导PKAC1磷酸化,进而使CREB发生磷酸化并结合到CRE元件上,增强20E诱导基因表达。结论及意义20E调控CaMKII氨基酸序列的第290位苏氨酸磷酸化并入核,催化HDAC3磷酸化并出核,从而维持USP1在303位赖氨酸的乙酰化修饰,与EcRB1结合形成EcRB1/USP1转录复合体并结合在EcRE上,启动基因转录。20E通过ErGPCR2介导PKAC1磷酸化,PKAC1直接磷酸化CREB中的第143位丝氨酸残基,使CREB与CRE结合,增强20E诱导基因表达。阐明了20E激发的Ca2+及cAMP增加引发的下游级联反应,丰富了类固醇激素的非基因组信号转导途径理论,为昆虫发育研究开辟了新的领域,为害虫控制提供了新的靶标。