论文部分内容阅读
背景压力性损伤(Pressure injury)又称压疮、褥疮,是临床常见并发症,其发生率高、难治愈,是护理工作的一大难题。难治性压疮多见于3、4期压疮,因皮肤全层破溃、炎症及窦道形成等,易并骨髓炎和骨坏死,更成为临床治疗难点。目前细胞治疗为难治性压疮提供新方向。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化、免疫抑制、分泌因子等等生物学特性,已成为慢性创面治疗中极有前景干细胞之一。MSCs是非均质细胞群,由多种具有不同生物学特性的亚群细胞组成,寻找治疗难治性压疮的优势亚群,具有较大临床意义。因脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal derived stem cells,ADMSCs)在体外易扩增和取材,伦理问题少等优势,在临床治疗中应用较广泛。CD73,一种外生-5’-核苷酸酶,定于细胞膜上的糖蛋白,具有核苷酶活性和信号传导功能。目前,CD73分子已用于多种疾病的治疗,如肿瘤、心肌损伤、器官移植等。评价CD73+ADMSCs治疗压疮的疗效,并全面分析其作用机制,可为临床开发CD73+细胞提供理论依据,进而为干细胞治疗压疮提供筛选细胞的分子标准。目的评价CD73+ADMSCs治疗小鼠压疮疗效,剖析CD73在ADMSCs促进难治性压疮创面修复机制。方法1.体外培养人脂肪间充质干细胞(ADMSCs)。2.干扰ADMSCs的CD73表达和抑制ADMSCs的CD73活性。构建GFP标记的CD73干扰慢病毒载体,转染ADMSCs,抑制CD73表达,用Western Bloting和Realtime PCR检测转染效率。使用CD73活性抑制剂5’-α,β-亚甲基二磷酸(APCP),抑制其活性。3.将ADMSCs接种于6孔板,实验分组:培养基对照组(Media Only)、空白对照组(ADMSCs组)、底物对照组(ADMSCs+AMP组)、CD73活性抑制组(ADMSCs+APCP+AMP 组)、慢病毒对照组(ADMSCs+LV+AMP)和 CD73 表达抑制组(ADMSCs+CD73siRNA+AMP组),液相色谱质谱仪检测细胞上清腺苷(ADO)含量。4.将8周龄的小鼠用磁片加压36h制备压疮模型,随机分为模型组(NC)、ADMSCs移植组、CD73活性抑制组(ADMSCs+APCP)、空病毒对照组(ADMSCs+LV)和CD73表达抑制组(ADMSCs+CD73siRNA),每组8只。采用多点注射1×106个(100μL)细胞治疗,NC组予等量PBS。5.治疗后3d、7d、14d,体视显微镜拍摄创面,计算创面愈合率;HE染色观察形态、炎细胞浸润和血管新生;免疫组化测压疮及周围CD31和VEGF表达;用Realtime PCR 检测组织 IL-10 和 TNF-α 表达。结果1.ADMSCs呈长梭形、多角形。病毒转染72 h,ADMSCs高表达GFP,ADMSCs+CD73siRNA组的CD73基因和蛋白较ADMSCs+LV组低,差异具有统计学意义(P<0.001)。2.与ADMSCs+AMP组比较,ADMSCs+APCP+AMP组的腺苷含量低但高于ADMSCs组,差异具有统计学意义(P<0.001),与ADMSCs+LV+AMP相比,ADMSCs+CD73siRNA+AMP组上清液中腺苷含量低,差异具有统计学意义(P<0.001)。3.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组愈合率高于NC组和ADMSCs+APCP组,有统计学差异(P<0.05);与ADMSCs+LV组比,ADMSCs+CD73siRNA低,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组CD31、VEGF免疫组化染色平均灰度值大于ADMSCs+APCP组,NC组最低,差异具有统计学意义(P<0.05);ADMSCs+LV组平均灰度值高于ADMSCs+CD73siRNA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5.移植后3d、7d、14d,ADMSCs组TNF-α mRNA的相对表达量低于ADMSCs+APCP组,NC组最高,差异具有统计学意义(P<0.05);与ADMSCs+LV组比,ADMSCs+CD73siRNA组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。ADMSCs组IL-10mRNA的相对表达量高于ADMSCs+APCP组,NC组最低,差异具有统计学意义(P<0.05);与ADMSCs+LV组比ADMSCs+CD73siRNA组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.应用CD73+ADMSCs可促进创面愈合,抑制ADMSCs表面CD73的表达或活性均会减缓愈合。2.CD73促创面高表达VEGF和CD31,加快局部血管新生,可能是其治疗难治性压疮的机制之一。3.CD73促创面高表达IL-10、低表达TNF-α,CD73+ADMSCs可能通过CD73/腺苷轴调控创面免疫微环境,促进难治性压疮愈合。