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脂肪酶是在油水界面上催化甘油酯分解或合成的一类酶的总称,可以催化解酯、酯交换、酯合成等反应。脂肪酶广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业,具有很高的应用价值。本文将一种海洋微生物来源的脂肪酶基因(命名为mas1)克隆至p PICZαA表达载体中,并在毕赤酵母X33中成功表达。为进一步提高表达量,对重组菌MAS1-p PICZαA/X33高密度发酵条件进行了优化,并探究了不同分子伴侣对其表达量的影响,并对该脂肪酶的酶学性质进行了研究。主要研究内容及结果如下:1.脂肪酶MAS1的基因克隆、表达及分离纯化将海洋微生物来源的脂肪酶基因mas1克隆至诱导型表达载体p PICZαA中,利用电击转化的方法将重组质粒整合到毕赤酵母X33基因组上,通过酵母菌落PCR及三丁酸甘油酯培养板的筛选,成功获得阳性重组毕赤酵母菌MAS1-p PICZαA/X33。对发酵上清液进行SDS-PAGE电泳分析,在29 KDa处存在明显的条带,与预期目的蛋白大小一致,说明目的基因mas1已经在毕赤酵母X33中成功表达。发酵上清液经金属螯合层析(镍柱)分离纯化,获得纯度在95%以上的纯蛋白。2.重组菌高密度发酵条件的优化在30-L发酵罐中对重组菌的高密度发酵条件进行了初步的优化,主要包括诱导温度,诱导p H以及碳源流加的种类。(1)在不同的温度(30℃、28℃、26℃、24℃和22℃)下诱导培养144 h,MAS1的酶活力随着诱导温度的降低而增加,在22℃时最大酶活力,总蛋白含量和菌体湿重分别为107 U/m L,0.678 g/L和450 g/L,分别是初始条件30℃(48U/m L,0.466 g/L,380 g/L)时的2.2,1.45和1.18倍。考虑到24℃条件下,酶活力为97 U/m L,为精确控温,节约能源,选取最佳诱导温度为24℃。(2)固定诱导温度为24℃,在不同的诱导p H4.0-8.0条件下,在p H6.0处达最高酶活240 U/m L,总蛋白含量0.867 g/L,分别是初始p H5.0的2.47和1.34倍。p H 4-7范围内,对菌体的生长几乎没有影响,湿重均在450 g/L左右,但是当诱导p H为8.0时,重组菌已经不能正常生长,几乎检测不到脂肪酶酶活。(3)在最佳诱导条件24℃、p H6.0下,进一步探讨了甲醇单独诱导、甲醇-山梨醇混合诱导及甲醇-甘油混合诱导对MAS1表达量的影响。结果表明,甲醇-甘油混合诱导效果最好,能将酶活力从240 U/m L提高到280 U/m L,菌体湿重从458 g/L提高到480 g/L。3.分子伴侣对脂肪酶MAS1表达量影响的研究以重组菌MAS1-p PICZαA/X33为出发菌,将4种分子伴侣(内质网压力响应蛋白HAC1、二硫键异构酶PDI、透明颤菌血红蛋白VHB及重链结合蛋白Bip)的基因克隆至MAS1-p PICZαA/X33中,实现分子伴侣与目的基因的共表达。结果表明,HAC1、PDI、VHB这3种分子伴侣对MAS1的表达均有不同程度的促进作用,在最佳条件24℃、p H6.0下诱导培养144 h后,共表达重组菌株的酶活力分别为330 U/m L、440 U/m L和340 U/m L,分别是出发菌株(240 U/m L)的1.37,1.81和1.41倍。而Bip基因对MAS1的表达表现出抑制作用,共表达重组菌酶活力只有160 U/m L。4.脂肪酶MAS1的酶学性质分析对脂肪酶MAS1的酶学性质进行分析,结果显示,其最适温度为40℃,具有良好的热稳定性;最适p H为7.0,并在p H5.0-9.0之间具有良好的储存稳定性,是一种偏碱性脂肪酶;对不同的金属离子(终浓度为1 m M)都具有良好的耐受性,4℃放置12 h后,残余酶活力均在83%以上。其中在终浓度为1 m M的Cu2+,Ca2+,Ni2+,和Mg2+.条件下,MAS1的酶活仍有初始酶活力的90%以上;对不同的有机溶剂具有良好的耐受性,而不同的表面活性剂对该脂肪酶活力均有不同程度的抑制作用,其中经终浓度为1%的Tween 20,Tween 60,Tween 80及Triton X 100处理后,相对残余酶活力仅为6.21%,5.4%,7.33%和23.9%;脂肪酶MAS1可以水解不同碳链长度的对硝基苯酚酯(C4-C18),其中对10个碳以下的短碳链人工底物C6、C8、C10水解能力都较强,对较长碳链的C12-C18水解能力较弱,对甘油二酯DAG的水解没有位置选择性。