背景：胰腺癌早期诊断难，恶性程度高，预后差，传统的治疗手段效果有限，总的5年生存率不足5％。包括EGFR靶向治疗和基因治疗在内的一些新的治疗手段迅速发展：抗EGFR单克隆抗体可以竞争性结合EGFR，阻断EGFR信号通路，发挥抗肿瘤效应，代表药物C225已在胰腺癌Ⅱ期临床试验中证实可以增强吉西他滨的作用；胰腺癌的基因治疗也已进展到了Ⅱ期临床试验，新型载体腺相关病毒因其表达持久稳定、感染谱广、免疫原性和致病性弱、无致肿瘤作用的特点越来越引起研究者的重视。本实验旨在将基因治疗技术与抗EGFR靶向治疗相结合，构建表达人抗EGFR单链可变区抗体的重组腺相关病毒(rAAV)载体，并筛选出对抗EGFR抗体敏感的细胞株，为后续的体内实验和临床开展抗EGFR单链抗体基因治疗奠定基础。 方法： (1)以包含CMV增强子、CBA启动子、嵌合内含子、人IX因子基因、polyA的rAAV载体为骨架，以重叠延伸法在骨架上引入新的单酶切位点，然后通过酶切将hFIX基因去除，插入目的基因； (2)用构建成功的质粒转染293细胞，通过WesternBlot法和免疫细胞化学法检测目的蛋白的表达； (3)将C225作用于六株胰腺癌细胞，通过CCK-8法测定各细胞生长曲线，PI染色法及AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡情况，筛选对C225敏感的细胞株。 结果： (1)hFIX基因两端引入了新的单酶切位点，通过常规克隆手段将hFIX基因替换为目的基因，测序结果符合预期； (2)利用GFP观察到293细胞的转染效率约为15-30％，利用WesternBlot法检测到了目的条带，同时免疫细胞化学法亦可观察到染色强弱的不同； (3)生长曲线显示C225对AsPC-1的生长有明显的抑制作用，其余五株则无，在第48、72小时AsPC-1的抑制率明显高于其它五株细胞，乙醇固定PI染色法未检测到细胞凋亡，AnnexinV-FITC与PI双染法可检测到C225引起AsPC-1细胞的早期凋亡。 结论： (1)包含抗EGFR单链抗体可变区基因的rAAV载体构建成功，并在293细胞中获得表达。 (2)AsPC-1对C225的敏感性明显高于其它五株胰腺癌细胞。