背景与目的近年来,在发达国家和发展中国家,儿童过敏性疾病患病率急剧上升。儿童过敏性疾病是动态发展的,常累及终身,极难治愈,尚无完全根除的方法,由此产生的社会经济负担巨大。因此,深入了解儿童过敏性疾病的发病机理以及开发新的有效的早期预防措施显得尤为重要。有研究提出假设,即过敏性疾病的发生与生命早期的肠道菌群缺损有关,以肠道菌群为靶点的干预措施（如益生菌）可能可以起到早期预防的作用。但是,生命早期肠道菌群缺损如何参与儿童过敏性疾病的发生发展尚不清楚,而益生菌对儿童过敏性疾病的预防效果则具有菌株特异性。因此,本研究拟利用动物实验探究抗生素诱导的生命早期肠道菌群缺损对宿主后期过敏性疾病的影响及潜在机制,并在菌株水平观察生命早期补充两歧双歧杆菌TMC3115可能的保护作用,以期进一步阐明儿童过敏性疾病的发病机制,并为儿童过敏性疾病的早期预防提供新的思路。方法本研究共分为四个部分,第一部分利用抗生素诱导新生小鼠肠道菌群紊乱,观察出生后早期肠道菌群紊乱对宿主的肠道发育和免疫功能的影响;第二部分利用抗生素和两歧双歧杆菌TMC3115改变新生小鼠的肠道菌群,之后诱发过敏,探究出生后早期肠道菌群与宿主后期过敏性疾病的关系及机制;第三部分利用抗生素诱导妊娠期母鼠肠道菌群紊乱,观察妊娠期母体肠道菌群紊乱对宿主胎盘菌群和后代免疫功能的影响;第四部分利用抗生素和两歧双歧杆菌TMC3115改变妊娠期母鼠肠道菌群,之后诱发后代过敏,探究妊娠期母体肠道菌群与后代过敏性疾病的关系及机制。各部分的具体的研究方法如下:1.新生小鼠分别灌胃生理盐水、头孢曲松和万古霉素至断乳（PND21）并处死,采集粪便、盲肠内容物、整个肠道和脾脏。使用PCR-DGGE检测小鼠肠道菌群多样性和群落结构;分别使用HE和IHC染色测量小鼠的小肠绒毛、结肠肠腺深度并检测KI67、MUC2和ZO-1表达情况;使用流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。2.新生小鼠分别灌胃生理盐水、头孢曲松、万古霉素、头孢曲松+两歧双歧杆菌TMC3115（TMC3115）、万古霉素+TMC3115、TMC3115至PND21。PND21时处死部分小鼠,之后行OVA刺激,共4次致敏,于PND56时处死剩余小鼠,收集血清、粪便、盲肠内容物、整个肠道和脾脏。使用ELISA检测小鼠血清IgE和OVA特异性-IgE水平;使用Luminex检测小鼠血清细胞因子含量;使用16S rRNA测序检测小鼠肠道菌群多样性和群落结构;分别使用HE、IHC和IF染色测量小鼠的小肠绒毛、结肠肠腺深度并检测KI67、MUC2和ZO-1表达情况;使用流式细胞术检测小鼠脾脏CD4+T细胞数量;使用GC-MS检测小鼠盲肠内容物SCFAs含量。3.妊娠期小鼠分别灌胃生理盐水和头孢曲松至临产,采用剖宫产无菌获得母鼠胎盘和新生小鼠,并采集母鼠的血清和粪便以及新生小鼠的血清。使用16S rRNA测序分析母鼠肠道菌群和胎盘菌群的多样性和群落结构;使用平板培养分离胎盘和新生小鼠血液中的活细菌,然后使用克隆测序检测其分类;使用Luminex检测母鼠和新生小鼠的血清细胞因子含量。4.妊娠期小鼠分别灌胃生理盐水、头孢曲松和两歧双歧杆菌TMC3115至自然分娩,后采集母鼠分娩结束时的粪便和血液以及部分新生小鼠的血液。至后代PND21时处死母鼠和部分幼鼠,之后行OVA刺激,共3次致敏,于PND49时处死剩余小鼠,采集血清、粪便、肠道和脾脏。使用16S rRNA测序检测小鼠肠道菌群多样性和群落结构,使用GC检测小鼠粪便SCFAs水平,使用HE染色测量小鼠回肠绒毛和结肠肠腺深度,使用RT-q PCR检测小鼠结肠KI67、MUC2、ZO-1、Claudin-1、Claudin-2和Occludin以及脾脏细胞因子和辅助性T细胞转录因子mRNA表达,使用ELISA检测小鼠血清IgG、IgM、IgA、sIgA、IgE、OVA特异性IgE、OVA特异性IgG1以及结肠内容物sIgA含量;使用Luminex检测小鼠血清细胞因子水平。结果1.出生后早期使用头孢曲松和万古霉素均能特异性地从数量和结构上损伤新生小鼠的肠道菌群,并显著损伤肠道组织结构,降低小肠绒毛和肠腺深度以及KI67和ZO-1的表达,导致MUC2的表达异常。然而,仅出生后早期使用头孢曲松显著降低了小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。2.新生小鼠灌胃头孢曲松和万古霉素均能不同程度地显著破坏其肠道菌群、肠道上皮细胞的结构和肠道屏障功能、降低SCFAs含量并影响血清总IgE水平;而上述变化在灌胃TMC3115的小鼠中未发现,如Bacteroides（拟杆菌属）的相对丰度未受影响,但该组小鼠的SCFAs含量显著升高。成年后,抗生素处理过的小鼠的肠道菌群的多样性和组成仍然与对照组具有显著差异,仅头孢曲松处理过的小鼠的血清总IgE、OVA特异性IgE和脾脏CD4+T细胞数量显著升高;而TMC3115可以显著降低IgE、OVA-特异性IgE水平和CD4+T细胞数量。3.妊娠期头孢曲松暴露显著降低了母鼠脾脏脏器指数,而新生后代的血清IL-6水平显著升高。头孢曲松处理的母鼠的肠道菌群发生了巨大变化,多样性显著降低,Bacteroidetes（拟杆菌门）丰度显著下降而Tenericutes（软壁菌门）迅速增殖并成为主要细菌。然而,胎盘菌群以Proteobacteria（变形菌门）为主导,特别是Ralstonia（罗尔斯顿菌属）,这与母体肠道菌群是显著不同的,且与母鼠妊娠期是否暴露于头孢曲松无关。此外,在胎盘和新生小鼠血液培养物中发现了活细菌。4.妊娠期头孢曲松暴露显著破坏了母鼠和后代的肠道菌群并降低SCFAs水平,且该破坏作用可持续至PND21甚至后代成年,OVA致敏后,成年小鼠的IgE、IgM、IL-12p70显著下降且脾脏IFN-γ和IL-10 mRNA表达有所下降。而妊娠期TMC3115暴露并未显著改变母鼠分娩结束时的肠道菌群和SCFAs水平;但是在PND21,母鼠及其后代的Firmicutes（厚壁菌门）和Lactobacillus（乳酸杆菌属）均显著增加并伴有SCFAs产量的恢复,同时血清IgE显著下降;在后代PND21天甚至成年后,结肠肠腺深度、KI67、MUC2和紧密连接蛋白的mRNA表达均不同程度地显著增强;OVA刺激后,小鼠的血清IgM、Firmicutes和Lactobacillus相对丰度以及粪便SCFAs产量显著增加,血清OVA特异性IgE、IgG1以及脾脏Th2型细胞因子IL-4、IL-5、IL-13和转录因子GATA-3的mRNA表达有所下降。结论1.出生后早期的抗生素暴露可导致肠道菌群紊乱并特异性地破坏肠道上皮细胞的增殖、黏液层和紧密连接的形成以及宿主免疫调节的能力。头孢曲松的上述破坏作用强于万古霉素,表明抗生素影响肠道菌群组成的效力可能是其影响宿主动物健康的关键因素。2.出生后早期头孢曲松诱导的肠道菌群紊乱和SCFAs下降以及肠道组织与免疫系统的发育异常会部分持续至成年,这可能与宿主后期增强的IgE介导的过敏反应和相关的免疫反应有关,而早期的TMC3115补充则可能通过调节宿主出生后早期的肠道菌群结构（如Bacteroides）并增加SCFAs含量进而降低宿主后期罹患IgE介导的过敏性疾病的风险。3.妊娠期头孢曲松暴露可诱导母体肠道菌群紊乱并对新生后代的免疫系统发育起到一定的调节作用,但不会显著影响胎盘菌群;子宫内并非无菌环境,胎盘含有区别与母体肠道菌群的独特的微生物群,应当在今后的研究中受到关注。4.妊娠期头孢曲松暴露诱导的母体和后代的肠道菌群紊乱和SCFAs下降以及免疫系统发育的异常会部分持续至后代成年,这可能与宿主后期对IgE介导的过敏反应的应答能力和一定程度的拮抗能力下降有关;而妊娠期补充TMC3115则可能通过显著增加母体和后代的有益菌（如Lactobacillus）和SCFAs水平,来增强宿主的肠道组织发育、肠道屏障功能和对过敏原的免疫应答能力。母体肠道菌群在母婴垂直传递以及后代的肠道菌群构建和免疫系统发育中具有不可忽视的关键作用,垂直传递的方式、参与菌群及其作用有待进一步研究。