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人乳铁蛋白(hLF)是一种具有广泛的生物学活性的铁结合糖蛋白。hLF基于其独特的生物学功能和理化性质,已广泛应用于食品、医疗、饲料添加剂等领域。然而,由于hLF来源的匮乏及加工过程造成的污染,使得其大规模的应用受到了限制。而乳腺生物反应器相对于传统的蛋白质表达系统,具有以较低的成本生产大量的活性蛋白的潜能。因此,利用基因工程技术开发重组人乳铁蛋白(rhLF)成为研究的热点和发展趋势。在前期的研究工作中,本实验室构建了含有人乳铁蛋白cDNA的rhLF乳腺特异性表达载体,获得了乳腺特异性表达rhLF的转基因奶山羊。本研究选用了其中两只rhLF转基因奶山羊(L6-4、L3-1)的羊乳汁,经过分离纯化,鉴定其是否与hLF具有相一致的生物学活性。分别收集转基因奶山羊L6-4、L3-1羊乳汁,离心去除脂肪,酸化沉淀去除酪蛋白,获得乳清。将乳清利用三次硫酸铵沉淀法最终得到沉淀物用超纯水溶解,溶解后的溶液用PBS(PH7.4)作为透析液透析24h,再经PEG20000浓缩至30mg/ml后进行Western-blotting检测。将上述浓缩后的溶液稀释至20mg/ml,以进样量为4ml,流速为0.5ml/min,缓冲液PH值为7.4的条件进行凝胶过滤层析以获得rhLF。将通过凝胶过滤层析获得的rhLF经Western-blotting免疫检测后稀释至2mg/ml,取10μL滴加到直径6mm的滤纸片上,紫外灯照射后放置在涂布大肠杆菌菌液的平皿中,37℃恒温培养14-16h后检测抑菌圈大小。将通过凝胶过滤层析获得的rhLF与适量的Tris-HCL缓冲液、NaHCO3溶液及Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O溶液混合,25℃反应10min,通过紫外分光光度计对上述混合液进行全光谱扫描。实验结果显示,利用硫酸铵沉淀法最终获得的rhLF经Western-blotting检测,可特异性的与兔抗hLF抗体结合,且具有与hLF分子量相一致的条带。通过凝胶过滤层析收集到的各个洗脱峰峰值处的洗脱液,经Western-blotting检测,rhLF均在第一个洗脱峰处被分离得到。对大肠杆菌的抑菌实验结果显示,相同蛋白浓度(2mg/ml)的rhLF和hLF均能产生抑菌圈,对大肠杆菌的生长具有明显的抑制作用,说明rhLF和hLF具有相一致的抑菌活性。铁结合实验结果显示,rhLF和hLF结合铁离子后均在465nm处出现明显的吸收峰,说明rhLF和hLF具有相一致的铁结合活性。通过本研究初步表明,本实验室所培育的转基因奶山羊,羊乳汁中表达的rhLF具有与hLF相一致的分子量大小和生物学活性。这些都为hLF进行大规模的生产应用尊定了基础。