利用人转录因子siRNA文库筛选凋亡相关siRNA

来源 :中国协和医科大学(北京协和医学院) 北京协和医学院 中国医学科学院 清华大学医学部 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pigho
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RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA分子引发的序列特异性转录后基因沉默过程。该现象广泛存在于多物种中。RNA干扰所致的同源基因降解现象引起生物学家的广泛关注并将其改造成一种人为的基因阻断技术,用于基因功能的研究。由于长双链RNA分子在哺乳动物细胞能引起非特异性的干扰素反应,RNAi技术的应用最初局限于线虫、果蝇等低等生物。随着siRNA(small interfering RNA)特异性抑制作用的发现,RNAi技术的应用范围延伸到哺乳动物;并且从对单一、特定基因的研究迅速推及全基因组水平的功能研究,以此为契机推动了siRNA文库的构建和使用siRNA文库进行高通量筛选。 凋亡又叫做程序性细胞死亡。凋亡有其特有的形态学特点和生化机制。凋亡对于各种生命过程非常重要,如正常的细胞更新、发育和免疫反应,激素依赖性组织萎缩,胚胎发育和化学物质诱导凋亡等。凋亡失常与许多人类疾病有关,如神经退行性疾病、缺血损伤、自身免疫和肿瘤等。调节细胞凋亡对于治疗这些疾病非常重要。因此,很多研究致力于分析阐明细胞凋亡的机制和信号通路。 我们利用人转录因子siRNA文库在Jurkat细胞中筛选凋亡相关siRNA。siRNA文库稳定转染细胞后使用rhTRAIL诱导凋亡。由于siRNA作用,那些具有抗凋亡特性的细胞将会存活、增殖,其他细胞将会被筛除。最终,那些具有抗凋亡特性的细胞在细胞群中得以富集。经过3轮筛选,稳定转染人转录因子siRNA文库的实验组细胞较稳定转染NC的阴性对照组细胞具有显著增强的抗凋亡能力。随后通过PCR--克隆--测序的方法获知这些阳性细胞中所转染的siRNA表达片段序列。然后这些siRNA表达片段的抗凋亡作用被逐个验证。其中部分siRNA表达片段在Jurkat细胞中表现出明确的抗细胞凋亡作用。 综上所述,我们建立了基于细胞功能表型的高通量siRNA文库筛选方法;用人转录因子siRNA文库成功地进行了大规模筛选,获得了多个与细胞凋亡相关的siRNA序列。为发现新的凋亡相关基因奠定了基础。
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