目的本研究筛选与Brag2蛋白亲和力最高的AMPA受体病理性内吞阻滞多肽Glu A2-3Y并通过环化策略修饰,进而提高多肽药物的穿膜效率、体外血浆稳定性和神经保护活性。方法生物大分子相互作用检测:本研究基于Glu A2-3Y序列设计了一系列多肽,用表面等离子共振技术筛选与Brag2蛋白结合的关键性氨基酸及亲和力最高的序列,利用分子对接技术对表面等离子共振结果进行解释。多肽合成方法:通过Fmoc法固相合成所需多肽,并在树脂上完成多肽固相环化。多肽穿膜效率评价方法:用MDCK-MDRI细胞跨膜转运模型和PAMPA跨膜转运模型评价多肽药物穿透生物膜的能力,计算各个药物组的表观渗透系数。多肽细胞活性评价方法:将各组多肽梯度10、50、100、500、1000μM的浓度,与高分化状态PC-12细胞共孵育30 min,加入30 m M的谷氨酸,与细胞共孵育24 h,加入CCK8用酶标仪在450 nm波长下检测细胞吸光度,计算细胞存活率。多肽药物安全性评价方法:将细胞活性实验筛选出活性较好的肽配成1、10、20、50、100、500、1000μM的浓度,将各组肽与PC-12细胞共孵育3 h,加入CCK8用酶标仪在450 nm波长下检测细胞吸光度,计算细胞存活率。将细胞活性实验筛选出活性较好的肽配成终浓度为1、10、20、50、100、500、1000μg/m L,与6%大鼠红细胞共孵育3h,用酶标仪在450 nm波长下检测红细胞的吸光度,计算溶血率。动物活性评价方法:用C57小鼠构建MCAO模型,腹腔注射阳性对照药物Tat-Glu A2-3Y和实验组药物,每个药物按2 mg/kg,4 mg/kg和8 mg/kg的剂量,比较小鼠的脑梗死面积和神经系统评分。结果Glu A2-3Y通过更强的范德华力、氢键和疏水作用与Brag2蛋白结合,亲和力最高,分子对接中也是Glu A2-3Y的结合自由能最高为143.692 kcal/mol,分子对接结果与表面等离子共振结果一致。通过环化策略,合成了研究中所需的8条环肽,环化后发现CMT-3Y1,CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y穿膜效率在MDCK-MDR1细胞跨膜转运模型和PAMPA跨膜转运模型上均提高了3～4倍;细胞活性方面,CMT-C3Y的活性最高,其EC50值为29.82μM;稳定性方面所有环肽的血浆稳定性均高于线性肽Tat-Glu A2-3Y,其中CMT-C3Y的血浆稳定性最好;CMT-3Y1、CMT-3Y2、MT-C3Y和CMT-C3Y的细胞毒性与Tat-Glu A2-3Y比差异没有显著性(F组别=0.153,P＞0.05),CMT-C3Y在安全范围内;CMT-C3Y在4 mg/kg和8 mg/kg的剂量下神经系统评分和脑梗死面积与阳性对照Tat-Glu A2相比差异具有显著性（均值差0.80～8.66,P＜0.05）。结论在Glu A2-3Y九个氨基酸序列范围内,多肽包含的氨基酸数目越多,结合自由能负值越高,多肽与Brag2蛋白能量体系越稳定。多肽经环化修饰后,脂溶性提高有助于穿透生物膜;通过构象限制、D型氨基酸和非天然氨基酸等修饰策略,能够降低多肽在血浆中的水解速度,提高多肽稳定性;同时环肽修饰策略限制了多肽的构象,减少线性肽的熵损失,提高了多肽的活性。此外,CMT-C3Y对脑卒中治疗效果最好。