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背景与目的:草甘膦除草剂（Glyphosate-based herbicides,GBH）商品名为农达,由于其高效、广谱、低成本等优点,成为目前世界上使用最广泛的农用化学品。农业操作和食物接触是人体暴露GBH的主要途径。近年来,随着抗草甘膦作物的大面积种植,GBH的施用量明显增加。这不仅对土壤、地表水和地下水造成污染,甚至在人类的食物、血液、尿液及母乳中也检测到其残留和代谢物,对人类健康构成了潜在危害。研究表明,GBH暴露对机体造成神经、肝肾、免疫以及生殖等多种毒性效应,其中生殖毒性引起人们的广泛关注。在雄性动物中,GBH降低精子数量和活力,增加精子畸形率,并降低雄性后代血清睾酮水平。在雌性动物中,GBH可干扰激素分泌,减少卵泡发育,诱发卵巢衰竭。妊娠期间GBH暴露将导致早期胚胎植入失败、活产率下降及子代出生缺陷等不良妊娠结局。正常的子宫蜕膜和胎盘的生长发育对胚胎着床和妊娠维持具有十分重要的作用。但在GBH生殖毒性的研究中,尚未见GBH暴露对子宫蜕膜化和胎盘生长发育的影响及其作用机制。故本研究旨在探讨GBH暴露对妊娠小鼠子宫蜕膜化和胎盘生长发育的影响及其作用机制。方法:正常妊娠或假孕小鼠通过灌胃的方式给予不同浓度GBH(0、5、50 mg?kg-~1?day-1)8天或13天后,于妊娠和假孕第8天或妊娠第13和19天,收集子宫、胎盘等组织,称重、拍照,统计胚胎植入数和吸收数;苏木素伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色观察统计子宫蜕膜多核化细胞数和胎盘面积;免疫组化检测蜕膜和胎盘增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞数、蜕膜组织Desmin蛋白表达、子宫自然杀伤（uterine natural killer,u NK）细胞数和血管生成情况;TUNEL染色检测蜕膜和胎盘凋亡细胞数;酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测胎盘组织凋亡途径、氧化应激和炎症水平;实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR analysis,q PCR）检测蜕膜粘附因子Sele、Selp、Icam2、Icam5、Vcam1、Cdh5和胎盘内质网应激相关基因GRP78、PERK、IRE1、ATF6、XBP1以及CHOP的表达水平;免疫印迹（Western blot,WB）检测蜕膜细胞的凋亡和自噬以及胎盘细胞的凋亡和内质网应激相关基因表达水平;透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）检测蜕膜细胞自噬小体形成情况。另外,为了进一步验证自噬是否参与了GBH暴露对子宫蜕膜化的影响,在给与GBH同时,于妊娠第1、4、7天腹腔注射0.04 mg?kg-1雷帕霉素,于妊娠或假孕第8天收集子宫等标本,进行相关实验分析。结果:第一部分小鼠妊娠期GBH暴露对子宫蜕膜化的影响及其作用机制1.与对照组相比,GBH暴露明显减少妊娠第8天小鼠胚胎植入数并降低子宫重量;通过对小鼠进行人工诱导蜕膜化发现,低剂量和高剂量组GBH均明显降低假孕第8天打油侧子宫重量和打油侧子宫重量与非打油侧子宫重量比。2.在正常妊娠和假孕第8天,与对照组相比,GBH暴露明显减少蜕膜多核化细胞数,降低蜕膜标志分子Desmin和Cyclin D3蛋白的表达,损害子宫蜕膜化进程。3.在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,GBH暴露明显减少PCNA阳性细胞数,增加蜕膜组织凋亡细胞数。WB结果显示,GBH暴露下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,而凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达水平明显上调,提示GBH暴露加速了子宫蜕膜组织的凋亡进程。4.WB结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,GBH暴露明显下调自噬相关蛋白Atg5、Beclin 1和自噬标志蛋白LC3-II的表达以及LC3-II/LC3-I的比值,自噬负相关蛋白p62表达上调;TEM结果显示,与对照组相比,GBH暴露导致自噬小体形成减少,提示GBH暴露抑制了子宫蜕膜细胞的自噬。5.在正常妊娠和假孕状态下,与对照组相比,q PCR和免疫组化结果显示,GBH暴露明显减少蜕膜粘附因子Sele、Selp、Icam2、Icam5、Vcam1、Cdh5 m RNA的表达水平,降低u NK细胞数量,并减少血管生成分子CD34蛋白的表达。6.在正常妊娠状态下,与单独GBH暴露组相比,同时给予雷帕霉素,可有效逆转GBH暴露所致的胚胎植入数和子宫重量的减少。在假孕状态下,与单独GBH暴露组相比,同时给予雷帕霉素,打油侧子宫重量和打油侧与非打油侧子宫重量比又基本恢复正常。7.WB结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与单独GBH暴露组相比,同时给予雷帕霉素,可明显增加自噬标志蛋白LC3-II表达和LC3-II/LC3-I的比值,并促进自噬相关蛋白Beclin 1和Atg5的表达水平升高,降低p62的蛋白表达水平。8.qPCR与免疫组化结果显示,在正常妊娠和假孕状态下,与单独GBH暴露组相比,同时给予雷帕霉素,可明显增加子宫粘附因子Sele、Selp、Icam2、Icam5、Vcam1、Cdh5 m RNA的表达,同时u NK细胞数量也明显上升。第二部分小鼠妊娠期GBH暴露对胎盘生长发育的影响及其作用机制9.与对照组相比,GBH暴露可明显降低妊娠13天存活胎儿数,增加妊娠19天胎儿重吸收数,并导致妊娠19天胎儿和胎盘重量下降;10.HE染色显示,GBH暴露明显减少妊娠13天和19天小鼠胎盘总面积和海绵体滋养层面积,从而抑制胎盘发育。11.在妊娠13天和19天,与对照组相比,GBH暴露明显减少胎盘细胞PCNA阳性细胞数和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,增加了凋亡细胞数并上调促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-12的表达,提示GBH暴露抑制胎盘的增殖并诱导胎盘凋亡。12.ELISA检测发现,在妊娠13天和19天,与对照组相比,GBH暴露对胎盘组织caspase-8和caspase-9蛋白的表达无明显影响,但caspase-12蛋白的表达水平明显上升,表明GBH暴露导致胎盘细胞凋亡可能主要通过内质网应激信号通路实现。13.qPCR和WB结果显示,与对照组相比,GBH暴露可导致妊娠13天和19天内质网应激相关基因GRP78、PERK和CHOP的m RNA和蛋白表达水平的增加,提示GBH暴露激活内质网应激GRP78/PERK/CHOP信号通路。14.胎盘组织氧化应激相关指标检测发现,在妊娠13天和19天,与对照组相比,低剂量和高剂量组GBH均明显增加了胎盘细胞内MDA的含量,且降低了细胞内抗氧化酶SOD和CAT的活性,提示GBH暴露可诱导胎盘发生氧化应激。15.通过ELISA检测小鼠妊娠13天和19天胎盘组织的炎症水平发现,GBH暴露对胎盘组织炎症因子水平无显著影响,仅高剂量GBH处理可导致妊娠19天白细胞介素6（interleukin 6,IL-6）水平的下降。结论:1.孕期母体暴露于GBH,将导致小鼠妊娠早期胚胎植入数下降、子宫重量降低,同时导致小鼠妊娠晚期胎儿体重降低、流产率升高等不良妊娠结局。2.GBH暴露通过抑制蜕膜细胞的自噬和粘附分子的表达,导致u NK细胞在蜕膜组织驻留不足和内膜的血管生成障碍,影响子宫蜕膜化的建立。而同时给予雷帕霉素,可通过增加子宫内膜的自噬、粘附分子表达和u NK细胞的驻留,有效逆转GBH暴露所致的胚胎植入数和子宫重量的下降。3.GBH暴露可能通过内质网应激介导GRP78/PERK/CHOP信号通路的激活损害胎盘的生长发育。