论文部分内容阅读
研究背景:心肌纤维化是心肌梗死(Myocardial infarction,MI,心梗)后心肌重塑的重要病理进程。过度的心肌纤维化将损害左室顺应性,进而导致心力衰竭甚至引起心脏性猝死(Sudden cardiac death,SCD)。因此,抑制心梗后心肌纤维化成为改善心梗患者预后的重要治疗策略。迄今为止,越来越多的证据表明泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)参与调控了心肌纤维化。FAT10(Human HLA-F adjacent transcript 10)作为类泛素蛋白家族成员,可直接介导靶蛋白经蛋白酶体降解,并调控细胞凋亡等多种生物功能。本课题组首次发现FAT10在心脏组织中表达,抑制缺氧引起的心肌细胞凋亡和自噬水平,稳定离子通道表达抗心律失常,在心梗中发挥保护作用。然而,FAT10在心梗后心肌纤维化的具体作用及分子机制尚不清楚。研究目的:本研究旨在探索FAT10对心梗后心肌纤维化的调节作用及其具体分子机制,为寻找治疗心梗后心肌纤维化的药物新靶点提供实验依据。研究方法:本研究采用同源重组的方法构建系统性FAT10基因敲除(Fat10-/-)品系小鼠,建立小鼠心梗模型以及成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)纤维化模型,从动物和细胞水平探讨FAT10对心梗后心肌纤维化的调节作用及其分子机制。具体如下:1、在体实验探究FAT10对心梗后心肌纤维化的影响实验选取8周龄雄性Fat10-/-小鼠,对照组为年龄及性别均相匹配的同窝野生型(wild-type,WT)小鼠。通过冠状动脉左前降支结扎术(Left anterior descending coronary artery,LAD)建立心梗诱导的小鼠心肌纤维化模型。马松染色(Masson staining)检测各组心肌纤维化程度;Western blot、免疫组化、组织荧光学检测心肌组织中相关纤维化指标(a-SMA、Colleagen-1、Colleagen-3)的表达变化;心脏彩超观察心功能指标的变化;作为补充验证,LAD中心尖部局部多点注射Fat10基因过表达(ad-Fat10)病毒,对比等量载体病毒注射动物组(ad-con)进行组织学及心功能变化的检测。2、离体实验探究FAT10对CFs增殖和迁移的影响体外模型中,利用TGF-β1处理CFs建立心肌纤维化的细胞表型。构建过表达和干扰FAT10腺病毒。Western blot检测FAT10对CFs中相关纤维化指标的表达变化;Ed U试验检测FAT10对CFs增殖的影响;细胞迁移实验(Transwell)、细胞划痕以及实时无标记细胞分析(Real time cellular analysis,RTCA)实验检测FAT10对CFs迁移的影响。3、探索FAT10影响心肌纤维化过程的关键蛋白蛋白质液相色谱-质谱联用(LC-MS)寻找FAT10潜在的底物蛋白,并在其中筛选参与纤维化进程的关键蛋白,利用Western Blot进行验证。4、明确FAT10通过靶向调控Smad3影响心肌纤维化LC-MS提示促纤维化关键蛋白Smad3(Smad family member-3)为FAT10的潜在底物蛋白。小鼠模型中,选用Smad3特异性抑制剂SIS3进行在体回复实验。Masson染色检测心肌纤维化程度;Western blot、免疫组化、组织荧光学等方法检测心肌组织中相关纤维化指标的表达变化;心脏彩超观察心功能指标的变化。离体CFs中,构建Smad3过表达和干扰病毒进行细胞回复实验,Ed U试验检测CFs增殖的影响;Transwell、划痕以及RTCA实验检测CFs迁移的影响。5、明确FAT10对Smad3表达调节的分子具体机制使用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX),蛋白酶体抑制剂(MG132),明确FAT10是否影响Smad3降解。利用干扰泛素病毒、干扰FAT10特异性E1激活酶(Uba6)病毒和干扰FAT10特异性E2转移酶(UBE2Z)病毒明确具体降解机制。使用免疫共沉淀、免疫荧光及GST-Pull down等技术明确FAT10和Smad3蛋白之间的相互作用。构建Smad3分段和突变质粒寻找FAT10与Smad3具体结合片段和位点。构建Smad3突变病毒进行功能实验,明确FAT10对心梗后心肌纤维化的抑制作用是否与直接靶向Smad3相关。研究结果:1、敲除FAT10加重小鼠心梗后心肌纤维化与对照组相比,Fat10-/-小鼠心梗后心肌纤维化程度加重,促纤维化蛋白的表达增加,心功能下降。2、过表达FAT10改善小鼠心梗后心肌纤维化Fat10-/-小鼠中,转染过表达FAT10腺病毒组小鼠心肌组织纤维化程度均较阴性对照组明显降低,促纤维化蛋白的表达下降,心功能得到明显改善。上述实验结果提示FAT10在心梗后心肌纤维化中的保护作用。3、FAT10抑制TGF-β1诱导的CFs纤维化反应过表达FAT10可以明显抑制TGF-β1诱导的CFs增殖、迁移和向肌纤维细胞的转化。相反,抑制FAT10可以明显促进TGF-β1诱导的CFs增值、迁移和转化。4、Smad3是FAT10抑制心梗后心肌纤维化的关键分子通过IP-MS技术首次揭示Smad3是FAT10的底物结合蛋白,且Western Blot实验显示FAT10负调控Smad3的蛋白表达。体内回复实验提示Smad3特异性抑制剂-SIS3可阻断由FAT10缺失诱导的心梗后心肌纤维化加重。体外实验则进一步验证干扰Smad3后,过表达FAT10抑制细胞纤维化反应的作用消失。5、FAT10介导Smad3经FAT10-蛋白酶体系统(FAT10-proteasome system,FPS)降解降解速率实验显示过表达FAT10后,随着CHX作用时间的延长,Smad3蛋白表达较对照组下降速率显著升高;而干扰FAT10后下降速率平缓。提示FAT10促进Smad3降解,然而这种作用被干扰FAT10特异性E1激活酶(Uba6)病毒和干扰FAT10特异性E2转移酶(UBE2Z)阻断。此外,干扰泛素Ub后FAT10对Smad3的降解作用依然存在,提示FAT10降解Smad3不依赖Ub。证实FAT10促进Smad3经FAT10介导的蛋白酶体系统降解6、FAT10与Smad3-K378位点直接结合为探索FAT10调控Smad3的具体机制,根据Smad3的蛋白结构将其分为3个功能片段,并构建片段质粒。GST-Pull down实验发现FAT10与Smad3-D3相互结合。将Smad3-D3片段的4个赖氨酸(Lys,K)位点分别突变为精氨酸(Arg,R)(K333R、K341R、K378R、K409R),免疫共沉淀实验发现K378R位点突变后,Smad3与FAT10的相互结合作用消失,以上结果证实FAT10通过和Smad3的K378位点直接结合。7、FAT10通过Smad3-K378位点发挥其调控纤维化的作用构建Smad3-K378R突变病毒(Smad3-K378R-MUT)和对照病毒(Smad3-K378-WT),分别和过表达FAT10病毒共转染至NRCFs中,以观察Smad3-K378位点突变后FAT10对纤维化的调控是否还存在。结果显示,在对照组中,过表达FAT10可明显抑制纤维化,包括纤维化标志蛋白水平的减少以及增殖和迁移程度的下降。但是,当突变病毒组和过表达FAT10共转染时,过表达FAT10对纤维化的抑制作用明显被阻断,进一步证实FAT10通过Smad3-K378位点发挥其调控纤维化的作用。结论:1、首次发现敲除FAT10加重小鼠心梗后心肌纤维化,过表达FAT10可改善上述表型。2、体外细胞实验证实过表达FAT10抑制TGF-β1诱导的细胞纤维化反应。3、首次发现Smad3是FAT10抑制心梗后心肌纤维化的关键效应物。4、FAT10促进Smad3经FAT10介导的蛋白酶体系统降解。5、FAT10通过与Smad3-K378位点直接结合发挥其在心梗后心肌纤维中的保护作用。