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研究背景:平足蛋白（podoplanin,PDPN）被证实在多种癌症中表达上调,其中包括人导管型乳腺癌。乳腺癌近年来发病人数逐年上升,而乳腺癌本身具有易转移、易耐药,易复发等特点,因此乳腺癌在临床有效治疗较难实现。而PDPN作为人体内血小板表面C型凝集素受体CLEC-2的唯一配体,PDPN与CLEC-2的相互作用被证实在癌症发生、转移中发挥了重要的作用,PDPN/CELEC-2轴也因成为肿瘤治疗相关靶点而备受关注。但PDPN在乳腺癌中的作用机制研究仍不明确。本研究先前制备了功能阻断性小鼠抗人平足蛋白（hPDPN）单克隆抗体（mAb）SZ-168 IgG,已被证实可以抑制黑色素瘤的生长和转移,但SZ-168 IgG在乳腺癌治疗中的潜在应用价值尚不清楚。本研究结合先前实验基础,力求阐明PDPN/CLEC-2轴在乳腺癌发生、进展、转移中的作用及机制,初步评估SZ-168 IgG作为靶向PDPN/CLEC-2轴的抑制抗体在乳腺癌临床治疗中的应用潜力。目的:本研究旨在明确人乳腺癌细胞株MCF-7细胞表面PDPN高表达,通过体外实验及体内实验逐步阐明高表达PDPN的MCF-7细胞诱导血小板的聚集以及其提高MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭能力的作用及其机制;同时研究SZ-168在抑制乳腺癌肿瘤发生、发展的有效性及特异性,研究其拮抗机制,评估其开发成为靶向乳腺癌治疗药物的可能性。方法:1.采用Westernblot和流式细胞术检测MCF-7细胞中PDPN的表达。2.用ELISA法检测MCF-7细胞释放到细胞培养上清中的可溶性平足蛋白（sPDPN）水平。3.血小板聚集试验检测MCF-7细胞对血小板聚集、活化的诱导作用及SZ-168对MCF-7细胞诱导的血小板聚集的抑制作用。4.CCK-8增殖实验研究SZ-168对活化血小板促进的MCF-7细胞增殖能力的抑制作用。5.划痕实验及Transwell实验共同评估活化血小板对MCF-7细胞的迁移、侵袭能力影响。在此基础上探究SZ-168对MCF-7细胞在体外实验中对细胞迁徙及转移的抑制作用。6.裸鼠右腋下注射MCF-7细胞悬液建立乳腺癌原位瘤模型,观察小鼠成瘤状况及生存情况观察;采用抗人PDPN抗体SZ-168抗体进行干预实验,观察SZ-168 在动物体内模型中 的抗肿瘤效应、对荷瘤小 鼠的保护作用及研究 SZ-168在体内对PDPN/CLEC-2轴的拮抗机制。7.采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.2.0统计学软件。计量资料以平均数±标准差（X±S）表示,p＜0.05差异有统计学意义。结果:1.流式细胞术分析表明,PDPN在人乳腺癌细胞MCF-7的膜上高表达,表达率为92.3%,高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A（表达率0.2%）（P＜0.0001）。此外,蛋白质印迹分析证实了 MCF-7细胞裂解物中PDPN的表达,而正常乳腺上皮细胞MCF-10A细胞不表达PDPN。2.双抗夹心ELISA的结果显示 MCF-7细胞培养上清中sPDPN含量（21.31±3.4ng/ml）显著高于MCF-10A细胞（1.34±2.8 ng/ml）,差异具有统计学意义（P＜0.0001）。3.血小板聚集实验结果显示,SZ-168以剂量依赖方式抑制MCF-7细胞诱导的血小板聚集,相同剂量的阴性对照mIgG不具有这种抑制作用。40μg/mlSZ-168有效抑制血小板聚集率为73.9±3.0%,30 μg/ml SZ-168有效抑制血小板聚集率为38.6 ±1.5%。结果表明SZ-168能抑制MCF-7细胞诱导的血小板聚集。4.CCK8增殖实验结果表明,3.0×108个血小板与MCF-7细胞共培养促进MCF-7细胞增殖效应最明显。而SZ-168以剂量依赖性方式抑制了这种促进作用（P＜0.0001）。5.划痕实验显示,活化血小板刺激细胞迁移,添加活化血小板组细胞划痕于24小时后基本愈合。SZ-168显著抑制血小板诱导的细胞迁移,细胞培养24小时后划痕仍明显存在。对照组mIgG未表现出对细胞划痕愈合有影响（P＜0.0001）。Transwell法被采用以评价活化血小板和SZ-168对MCF-7细胞迁移以及侵袭能力的影响。将含有血小板的培养基添加到下室,诱导MCF-7细胞迁移及侵袭。迁移实验中添加血小板实验组迁移细胞数（129±3.4个）相较于未添加血小板组（52±2.3个）明显增多（P＜0.0001）。经60 μg/mlSZ-168（61±1.7个）处理可抑制这种现象。在侵袭实验中,血小板共培养组（69±5.2个）侵袭细胞数显著高于无血小板对照组（32±1.5个）（P＜0.0001）。相较于mIgG处理组（72±4.2）,活化血小板促进的侵袭效应被60μg/ml的SZ-168（40±2.8个）有效抑制。6.本研究于裸鼠右腋下成功建立裸鼠MCF-7乳腺癌移植瘤模型。原位移植瘤模型建立后,本实验室开始尾静脉注射抗体,行干预实验。相较于mIgG组,SZ-168抗体干预组肿瘤发生明显延迟,肿瘤体积和质量均小于对照组（P＜0.0001）。同时SZ-168干预组肿瘤基本不发生溃破,小鼠行动较为自如。7.本研究同样对乳腺癌荷瘤小鼠进行生存观察。结果显示,SZ-168显著提高了乳腺癌荷瘤小鼠生存率,整个实验期间也未发现抗体带来的其他负面效果。结论1.MCF-7高表达平足蛋白,正常乳腺上皮细胞MCF-10A不表达。MCF-7细胞持续、自主向周围环境中释放溶解性PDPN,不受LPS因子的影响。2.表达PDPN的MCF-7细胞诱导血小板活化和聚集,活化血小板促进MCF-7细胞的增殖、迁移、侵袭能力,抗人平足蛋白单抗SZ-168抑制MCF-7细胞诱导的血小板聚集,从而抑制MCF-7细胞的体外迁移和侵袭能力。3.本研究成功构建了乳腺癌原位移植瘤模型,在该模型验证了 SZ-168在MCF-7原位异种移植模型中的抗肿瘤效应和提高小鼠生存率的作用。4.SZ-168在MCF-7细胞乳腺癌原位移植瘤模型中显现了持续有效的抗肿瘤效应,因此SZ-168具有较高潜力成为抗乳腺癌靶向抗体免疫治疗剂。