【摘 要】
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果胶寡糖（POS）,是果胶水解后的产物,具有抗肥胖、抗糖尿病、抗菌性、抗感染等多种生物活性,在医药、食品和化妆品等领域具有重要应用。果胶寡糖主要通过生物酶法降解果胶来制备,果胶酶是常用的酶,其中果胶裂解酶可以在不破坏酯基的情况下降解果胶,是生产果胶寡糖的一种重要酶类,但其目前面临种类少且酶学性质无法满足工业应用等问题,因此发掘新颖的果胶裂解酶仍然是当前的研究热点。本论文的主要研究内容及结果如下:（
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果胶寡糖（POS）,是果胶水解后的产物,具有抗肥胖、抗糖尿病、抗菌性、抗感染等多种生物活性,在医药、食品和化妆品等领域具有重要应用。果胶寡糖主要通过生物酶法降解果胶来制备,果胶酶是常用的酶,其中果胶裂解酶可以在不破坏酯基的情况下降解果胶,是生产果胶寡糖的一种重要酶类,但其目前面临种类少且酶学性质无法满足工业应用等问题,因此发掘新颖的果胶裂解酶仍然是当前的研究热点。本论文的主要研究内容及结果如下:（ⅰ）生物信息学分析:实验室得到一株海生细菌,学名Echinicolapacififica,发现其可以降解果胶,从其基因库中找到一种果胶裂解酶PelA的基因（GeneBank:NZKB890738）,对果胶裂解酶基因进行系统发育树分析后得出该酶属于PL10家族,将该基因序列与PL10家族的其他酶的基因序列进行比对,结果发现序列相似度较低,具有一定新颖性。后续对该酶的氨基酸序列进行信号肽和跨膜结构预测分析,设计引物时去除信号肽,载体构建好后在E.coli BL21（DE3）中进行诱导表达。（ⅱ）蛋白纯化与酶学性质研究:利用Ni-IDA亲和层析柱对果胶裂解酶PelA进行纯化,在0.5 M咪唑浓度下洗脱得到纯度较高的蛋白,分子量大小在49 kDa左右。首先探究其底物专一性,结果表明PelA是果胶裂解酶,于是我们对PelA的酶学性质进行研究,发现该酶的最适pH是8.0,最适温度为30℃,有11种金属离子对PelA活性有抑制作用,只有Ca2+能促进其活性,表明其具有Ca2+依赖性。（ⅲ）PelA降解聚半乳糖醛酸的条件优化和产物分析:PelA降解聚半乳糖醛酸（PGA）的产物无法通过TLC分析,于是采用响应面的方式优化了 PelA酶解PGA的条件,优化后产量提高了 26%,用该产物经薄层层析（TLC）、乙醇沉淀、碳水化合物聚丙烯酰胺凝胶电泳（Carbohydrate-PAGE,C-PAGE）、凝胶渗透色谱（GPC）分析得到该酶解产物是高分子寡糖。验证PelA可以降解柑橘果胶,且许多柑橘果胶具有抗菌活性,于是我们从市售柑橘皮中提取果胶并对其进行降解,然后用上述方法对其产物进行分析,得出结论为该产物是大分子果胶寡糖。（ⅳ）橘皮果胶寡糖抗菌活性评价:为探究橘皮果胶寡糖的生物活性如何,分别对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等多种细菌做了抑菌活性进行评价,抑菌结果表明6.25 mg/mL的橘皮果胶寡糖对革兰氏阳性细菌抑制效果较明显,对革兰氏阴性细菌抑制效果较差,抑制率随着果胶寡糖的浓度降低而减弱,此结果可为工业应用提供理论支撑。
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