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2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, S. suis 2)是一种重要的人兽共患病病原。该菌不仅能引起猪疫病,给全世界养猪业造成巨大的威胁,而且严重影响着公共卫生安全。人类可通过直接接触感染该菌,导致脑膜炎、败血症、心内膜炎等,严重可致死亡。我国是本病的重灾区,1998年和2005年,我国江苏省和四川省分别发生S. suis 2暴发流行感染猪和人的公共卫生事件,患者中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome, STSS),病情凶险,病死率高达81.3%～97.4%。如此反复密集的爆发人感染2型猪链球菌事件,并造成严重后果,使得该病原菌的分子致病机制研究倍受国内外学者关注。S. suis 2的不同分离株致病性具有很大差异,可能与其毒力因子密切相关。已知荚膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS)是S. suis 2极为重要的毒力因子,无荚膜突变株在体外极易被猪肺巨噬细胞吞噬,经鼻粘膜接种仔猪无致病性。S. suis 2的CPS由5种单糖组成,分别为葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺和N-乙酰神经氨酸。其中,N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)又称唾液酸,是一种已在多种致病菌中被证实的毒力因子,该组分在S. suis 2中的致病作用尚不明确。本课题组对2005年四川流行的强致病株05ZYH33进行了全基因组测序和组功能注释。生物信息学分析结果显示,05ZYH33中含有唾液酸合成酶编码基因neuB。同源比对发现,05ZYH33的唾液酸合成酶NeuB与无乳链球菌中的唾液酸合成酶序列一致性高达91%。为探讨唾液酸在S. suis 2致病过程中的作用,本研究以强致病株05ZYH33为对象,唾液酸合成酶编码基因neuB为靶标,利用同源重组方法获得了neuB基因敲除突变株,对其进行深入细致的生物学功能研究。其实验内容和结果主要包括以下几个方面:1. 05ZYH33 neuB基因敲除突变株的构建:以S. suis 2强致病株05ZYH33基因组DNA为模板,PCR扩增neuB基因的上下游片断;同时以pSET2穿梭质粒DNA为模板,PCR扩增壮观霉素抗性基因Spcr,在限制性内切酶和T4连接酶的作用下,将它们依次克隆到pUC18载体的多克隆位点上,形成一个在Spcr两侧具有与靶基因同源序列的neuB基因敲除载体LSR- pUC18。将LSR- pUC18电转化05ZYH33感受态细菌,筛选具有壮观霉素抗性的S. suis 2菌落,扩大培养后提取基因组DNA,采用组合PCR验证和Southern杂交的方法证实neuB基因已被Spcr替换掉,从而获得具有壮观霉素抗性的neuB基因敲除突变株ΔneuB。2.基因敲除突变株ΔneuB的生物学特性研究:在相同的条件下,观察S. suis 2野生株05ZYH33与突变株ΔneuB的基本生物学性状的差异。结果发现,neuB基因敲除后,细菌能稳定生长,壮观霉素抗性表型能够在突变株中稳定传代。同时,neuB的缺失未明显影响细菌的菌落形态、溶血活性以及染色特性等生物学特性。但是与野生株05ZYH33相比,突变株ΔneuB的唾液酸含量明显下降,表面结构组分发生了显著变化,荚膜变薄,质地更加紧密;抗血清凝集特性也发生了改变,凝集时间明显延长;生长曲线中的延滞期延长,导致生长曲线右移;全血存活能力下降、黏附及侵袭能力有所提高。3. neuB缺失对细菌毒力的影响及免疫保护性试验:①用同等剂量(1mL)的野生株05ZYH33(108CFU)、突变株ΔneuB(108CFU)和THB分别腹腔注射BALB/c小鼠。结果发现,野生株05ZYH33组10只小鼠中有8只死亡,而neuB缺失的突变株组10只小鼠全部存活,仅部分小鼠轻微发病,THB阴性对照动物无明显发病或异常表现。②用同等剂量(1mL)的突变株ΔneuB(108CFU)和THB分别腹腔注射BALB/c小鼠,共免疫三次,其后腹腔注射野生株05ZYH33(108CFU)。结果发现,THB对照组10只小鼠全部死亡,ΔneuB免疫组10只小鼠中有7只死亡,突变株ΔneuB无明显的免疫保护作用。以上研究结果提示菌体荚膜中的唾液酸对于猪链球菌2型侵袭和致病具有重要作用。