目的:恶性黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一种较为常见的恶性肿瘤,皮肤黑色素瘤最为常见,恶性程度极高,其中转移性恶性黑色素瘤患者的长期生存率仅为5%[1],且恶性黑色素瘤的发病率呈逐年上升趋势。目前,治疗黑色素瘤的关键在于降低患病风险如日晒和早期发现早期诊断。治疗原位恶性黑色素瘤的首选方法仍然是手术切除,其他抗肿瘤方法疗效均较差,如:免疫治疗、放化疗等,而基因靶向治疗[2]虽具有较好的治疗前景但仍缺乏大规模临床研究,无法掌握其后续效应。于是寻求一种新的有效治疗方法具有极其重要的意义。近年来,众多学者发现2-甲氧基雌二醇具有抗肿瘤增殖、诱导细胞凋亡等活性,其可抑制多种恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等的发生发展,现已将其用于乳腺癌的临床治疗中。本实验旨在探讨2-甲氧基雌二醇对恶性黑色素瘤B16细胞增殖、侵袭及迁移的影响,从而为2-甲氧基雌二醇治疗恶性黑色素瘤的可能性提供新的理论基础。2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME)为内源性雌激素代谢产物,与雌激素受体结合能力较低,其毒性较低,代谢较快,生物利用率较低。在体外和动物实验模型研究中表明,2-ME具有抗多种肿瘤作用如乳腺癌[3]、前列腺癌[4]、肺癌[5]、胃癌[6]、宫颈癌[7]及骨髓瘤[8]等,其具体作用机制[9]为通过抑制血管内皮生长因子而抵抗血管新生、促使多种凋亡因子参与肿瘤细胞的凋亡及通过微管蛋白解聚等诱导细胞周期的停滞,还包括增强肿瘤细胞对幅射的敏感性等。近年来,由于2-ME毒副作用较少,其作为一种新型的抗肿瘤药物日益受到重视。方法:将体外培养的小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为研究对象,用不同浓度(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)的2-甲氧基雌二醇处理鼠恶性黑色素瘤B16细胞。1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在饱和湿度、37℃、5%CO2环境下(含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml,PH值7.3)培养鼠恶性黑色素瘤B16细胞。2倒置显微镜下观察细胞形态观察不同浓度2-ME培养鼠恶性黑色素瘤B16细胞48h后细胞形态学变化。3 MTT比色分析法检测不同浓度的2-ME在一定时间段内(24h、48h、72h)对鼠恶性黑色素瘤B16细胞增殖的抑制作用。4平板克隆形成实验检测经不同浓度的2-ME处理鼠恶性黑色素瘤B16细胞2周后的克隆形成能力,并以未处理的细胞作对照。5 Transwell侵袭小室测定方法检测经不同浓度的2-ME处理鼠恶性黑色素瘤B16细胞24h后细胞的穿Matrigel胶数目,观察药物在体外对细胞趋化侵袭能力的影响,并以未处理的细胞作对照。6 Transwell迁移实验方法检测经不同浓度的2-ME处理鼠恶性黑色素瘤B16细胞8h后细胞的穿膜数目,观察药物在体外对细胞迁移能力的影响,并以未处理的细胞作对照。7细胞划痕实验经10μmol/L 2-ME处理鼠恶性黑色素瘤B16细胞24h后观察划痕愈合程度,并以未处理的细胞作对照。8统计软件SPSS13.0对数据进行统计分析。结果:1倒置显微镜下观察细胞形态对照组细胞贴壁生长良好,细胞大多呈多角形,折光性好;经2-ME处理实验组,细胞生长缓慢,细胞变圆,可见散在分布皱缩明显细胞及破裂细胞,且随浓度升高,变圆及胞核固缩的细胞逐渐增多。2 MTT比色分析法经重复测量的方差分析显示:不同浓度的2-ME对黑色素瘤B16细胞的增殖的抑制作用存在差异,具有统计学意义,(F=920.78,P<0.05);在培养24h、48h、72h后2-ME对黑色素瘤B16细胞的增殖的抑制作用存在差异,具有统计学意义(F=6245.73,P<0.05);药物浓度和培养时间之间存在交互作用(F=1199.58,P<0.05)3平板克隆形成实验检测结果肉眼观察,与对照组相比,B16-10μmol/L,B16-20μmol/L,B16-40μmol/各组细胞形成的集落均较小,克隆形成数分别为(303.0±15.7)、(162.7±9.2)、(95.0±11.4)、(67.3±9.7),经方差分析统计学分析F=238.79,P<0.05,说明各组总体均数差异具有统计学意义。克隆形成率分别为:60.6±3.1%、32.5±1.8%、19.0±2.3%和13.5±1.9%,经LSD-t检验各组中任意两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。4 Transwell侵袭小室实验结果显示阴性对照组B16-negative细胞的体外侵袭能力较高,与实验组B16-10μmol/L,B16-20μmol/L,B16-40μmol/L细胞的体外侵袭能力相比,细胞侵袭能力差异显著,有统计学意义(F=115.4,P<0.05),实验组各组间侵袭能力亦具有显著差异(P<0.05)。5 Transwell迁移实验结果显示阴性对照组B16-negative细胞的体外迁移运动能力较高,与实验组B16-10μmol/L,B16-20μmol/L,B16-40μmol/L细胞的体外迁移运动能力相比,细胞迁移运动能力差异显著,有统计学意义(F=67.227,P<0.05),实验组各组间迁移能力亦具有显著差异(P<0.05)。6细胞划痕实验检测结果划痕试验证实阴性对照组的B16细胞经过24小时后几乎迁移至所有的划痕区域。而实验组B16-10μmol/L的划痕区域仅有部分由B16细胞占有。与阴性对照组相比,浓度为10μmol/L的2-ME对鼠黑素瘤细胞B16运动能力有抑制作用。结论:1 2-ME对鼠恶性黑色素瘤B16细胞的增殖具有抑制作用,且在一定浓度范围内和时间段内呈现时间-剂量依赖性。2三个浓度的2-ME均可以抑制鼠恶性黑色素瘤B16细胞的集落形成,抑制B16细胞的克隆形成能力。3三个浓度的2-ME均可以抑制鼠恶性黑色素瘤B16细胞的侵袭和迁移运动能力。