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第一部分Kir2.1-shRNA慢病毒载体的构建包装及其对大鼠血管平滑肌细胞Kir2.1基因敲减效率的测定目的首先构建针对SD大鼠内向整流钾离子通道2.1 （inwardly rectify K+channel2.1,Kir2.1）基因的特异性短发卡 RNA （short hairpin RNA, shRNA）表达的慢病毒（Lentivirus, LV）干扰载体,然后转染大鼠胸主动脉平滑肌细胞（rat thoracic aorta vascular smooth muscle cells , RASMCs）检测慢病毒对 Kir2.1基因敲减的效率。方法根据GenBank公布的NM017296.1序列确定四条针对Kir2.1基因cds区的小干扰 RNA （small interfering, siRNA）序列（shRNAl-4）,同时设计一条阴性对照序列用于shRNA阴性对照（Negative Control, NC）,共组建与shRNA相对应的5条互补的单链DNA。慢病毒颗粒由包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G和shRNA重组穿梭质粒组成,进行测序鉴定后,再转染293T细胞产生病毒液。RASMCs按照浓度5 X 105cells/mL被接种在6孔板,连同对照组（Control, CON）将细胞分为六组（shRNAl-4组、NC组、CON组）,以Kir2.1-shRNA慢病毒（Kir2.1-shRNA-Lv）感染复数为（multiplicity of infection, MOI） 100 进行转染,120 h 后使用荧光显微镜进行EGFP表达观察,并采用Western blot对五组进行Kir2.1的蛋白及达的检测。结果（1）成功构建含Kir2.1-shRNA的慢病毒载体;（2）为测定Kir2.1-shRNA-Lv在RASMCs内的转染效率,使用MOI=100转染120 h后,以荧光显微镜观察EGFP表达情况,在RASMCs内慢病毒载体的表达效率几乎达到了90%。（3）Western blot分析表明与对照组相比四条干扰病毒均明显抑制Kir2.1表达,其中sh-RNA3抑制效率最高,为最有效靶点组,而NC组与CON组内Kir2.1表达无明显差异。结论成功构建Kir2.1-shRNA-Lv载体,其中携带sh-RNA3的慢病毒对RASMCs具有高效转染效率并且抑制RASMCs内Kir2.1蛋白表达效果最好,可以作为后续实验的最佳病毒选择。第二部分Kir2.1-shRNA-Lv介导的Kir2.1基因沉默对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白影响的研究目的通过Kir2.1-shRNA-Lv敲减RASMCs中的Kir2.1基因,检测Kir2.1对血小板衍生生长因子 BB （platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白的影响。方法从大鼠胸主动脉中膜分离培养平滑肌细胞,通过Kir2.1-shRNA-Lv转染沉默 Kir2.1,72 h 后加入 PDGF-BB （25ng/mL）干预 24 h,采用 CCK-8 法和 BrdU免疫荧光染色法检测RASMCs增殖的情况,通过划痕和transwell小室实验检测RASMCs迁移的情况,通过Western blot检测干预后RASMCs表型蛋白表达的变化,以探讨Kir2.1沉默对PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移及表型蛋白的影响。结果（1）与NC对照组相比,单纯PDGF-BB （25ng/mL）诱导组细胞增殖明显增加,敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导的细胞增殖较单纯诱导组增殖显著减少。（2）与NC对照组相比,单纯PDGF-BB诱导组细胞迁移明显,敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导的细胞迁移较单纯诱导组显著减少。（3）与NC对照组相比,单纯PDGF-BB诱导组细胞舒张表型蛋白（osteopontin）表达增加而收缩表型蛋白（SM22α、SMα-actin、calponin）表达减少,敲减Kir2.1后对RASMCs进行PDGF-BB诱导较单纯PDGF-BB诱导的收缩表型蛋白明显增加而舒张表型蛋白减少。结论Kir2.1沉默可以抑制PDGF-BB诱导的RASMCs增殖、迁移和表型转换。第三部分慢病毒介导的Kir2.1基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤新生内膜影响的研究目的通过Kir2.1-shRNA-Lv敲减在体大鼠颈动脉Kir2.1来观察其对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的影响。方法24只SD雄性大鼠随机分为假手术组（Sham组）、生理盐水组（Saline组）、Kir2.1-shRNA-Lv敲减组（KD组）、阴性病毒对照组（NC组）,成功构建颈动脉球囊损伤模型后在球囊侧孔分别各组注入100μL生理盐水、100μL Kir2.1-shRNA-Lv病毒液、100μL阴性病毒液孵育30min,3周后取出损伤血管采用荧光显微镜及Western blot验证感染效率,HE染色分析内膜形态变化。结果（1） KD组和NC组荧光显微镜下可见绿色荧光的内膜和中膜形态:（2）与Sham组相比,Saline组和NC组Kir2.1蛋白表达明显增加,KD组的Kir2.1的表达较Saline明显减少;（3）与Sham组相比,Saline组和NC组新生内膜面积明显增加,KD组的新生内膜面积较Saline组显著减少,与Sham组相比,各组的中膜面积变化没有显著差异。结论Kir2.1-shRNA-Lv可以明显抑制在体RASMCs中Kir2.1的表达,并可以抑制大鼠球囊损伤后新生内膜的形成。第四部分Kir2.1参与调控PDGF-BB诱导的RASMCs表型转换的机制研究目的通过膜片钳技术来研究Kir2.1参与PDGF-BB诱导的RASMCs表型转换的调控机制方法使用 PDGF-BB 受体 α（PDGF-BBRα）和 β（PDGF-BBRβ）的抑制剂（AG1296和 AG1295 ）、PI3K/AKt 和 cAMP-PKA 信号通路抑制剂（GSK690693 和Rp-8-CPT-cAMPs）、cAMP 激动剂和抑制剂（Forskolin 和 SQ22536）,对 RASMCs进行干预,然后使用PDGF-BB （25ng/mL）诱导24 h,然后选择单个细胞,采用全细胞电压钳模式,使用protocol电压记录RASMCs的Kir2.1电流变化,Western blot检测PDGF-BB诱导后Kir2.1的表达。结果（1）膜片钳检测PDGF-BB诱导RASMCs后Kir2.1电流:与典型Kir2.1电流图（CON组）相比,加入Kir2.1通道抑制剂Ba2+后的电流显著被抑制,而单纯加入PDGF-BB诱导后的Kir2.1的电流较CON组增加;（2）与CON组相比,PDGF-BB诱导组的Kir2.1蛋白表达显著增加;（3）膜片钳检测PDGF-BBRα抑制剂和PDGF-BBRβ抑制剂干预RASMCs后,PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比,PDGF-BBRα干预组的Kir2.1电流未见明显变化,而PDGF-BBRβ干预组的电流明显减小。（4）膜片钳检测AKt抑制剂干预RASMCs后,PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比,加入AKt抑制剂的Kir2.1电流未见明显变化。（5）膜片钳检测PKA抑制剂干预RASMCs后,PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比,加入PKA抑制剂的Kir2.1电流明显减少。（6）膜片钳检测cAMP激动剂和抑制剂干预RASMCs后,PDGF-BB诱导的Kir2.1电流:与单纯PDGF-BB诱导组相比,加入cAMP激动剂组的Kir2.1电流显著增加,加入cAMP抑制剂组Kir2.1电流显著减少。结论PDGF-BB可能通过作用其受体PDGF-BBRβ后,激活信号通路cAMP-PKA来促进Kir2.1电流增加,导致RASMCs发生表型转换。