油脂在高温煎炸过程中会发生热氧化反应,产生一系列油脂氧化产物。本论文以煎炸过程中油酸(OA)氧化产生的9,10-环氧硬脂酸(ESA)为研究对象,系统优化了ESA固相萃取分离富集条件并评价了气相色谱检测方法的准确性,同时讨论其在不同氧化程度的煎炸油脂中的分布规律,分析不同煎炸油脂的脂肪酸组成对ESA形成过程的影响,探索其在高温氧化过程中的形成规律。同时,通过体外细胞实验研究ESA对HepG2细胞的毒性作用、氧化损伤以及脂质代谢方面的影响,并从分子水平上进一步研究ESA引起细胞凋亡及干扰细胞内脂质代谢的原因。本论文为阐明ESA在高温氧化条件下的形成机制以及其对细胞活力和脂质代谢的影响提供了理论依据,本论文的主要研究内容与结果包括:(1)实现了基于固相萃取技术和气相色谱技术检测煎炸油中ESA的定性定量分析。首先采用固相萃取技术对ESA进行分离富集并对影响萃取效率的因素(萃取柱类型、吸附剂含量、洗脱液类型及洗脱液体积)进行优化,得到的最佳萃取条件是采用填料为1 g硅胶固相萃取小柱,洗脱液为乙醚,洗脱液体积为15 mL。同时,在ESA气相色谱分析阶段,采用TR-FAME 260M154P色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25μm)测定煎炸油中的ESA并评价了该方法的准确性和重现性,结果表明该方法的加标回收率在89%以上,日内精密度范围为0.93%-2.35%,日间精密度范围为2.44%-11.68%。采用上述建立的方法检测不同煎炸介质中ESA含量随煎炸时间的变化发现,未煎炸的油脂中未检出ESA,煎炸棕榈油和葵花籽油中的ESA含量均随煎炸时间的延长逐渐增加,与煎炸5 h的油脂样品相比,煎炸50 h的棕榈油和葵花籽油中ESA分别增加了94.70%和97.02%,并且棕榈油中ESA含量始终高于葵花籽油。通过分析煎炸油脂中两种构型的ESA含量的变化发现,煎炸葵花籽油及煎炸初期棕榈油(0 h-15 h)中顺式ESA含量高于反式结构,而棕榈油经煎炸15 h后,油样中ESA的存在形式主要是稳定性更高的反式结构。通过测定煎炸油中OA含量的变化发现,煎炸初期(0 h-10 h)两种煎炸油中OA的损失率无差别,随着煎炸时间的延长,煎炸葵花籽油中OA的损失量高于棕榈油,并且在OA损失率相同时,煎炸棕榈油中ESA的含量高于葵花籽油。以上结果说明油脂氧化程度会影响体系中ESA的形成,并且不同脂肪酸组成的油脂会影响ESA在煎炸体系中的分布。(2)煎炸油中的ESA是通过OA热氧化产生的,本文采用电子自旋共振(ESR)方法分析了高温热处理条件下不同氧化程度的OA中自由基的变化规律,并结合OA氧化挥发性产物和ESA含量的变化规律推测了ESA在高温热氧化过程中的产生过程。结果表明,OA中自由基、挥发性化合物及ESA的含量随热氧化时间的延长而逐渐增加,而OA的含量则逐渐减少,并且相比于未经高温热氧化的OA,氧化末期的OA中OA含量降低了63.74%。OA体系中自由基的分布情况是烷基自由基为主导,伴随烷氧自由基的存在,OA在热氧化前期(0 h-30 h),体系内自由基含量较少,而在热氧化后期(35h-50 h),由于OA的氧化速率显著提高,体系内会生成大量的自由基。此外,在ESR28 min的检测范围内,体系内自由基含量呈现先升高再降低的趋势并且最后保持在恒定范围内。氧化OA中检测到的辛醛、壬醛、(E)-2-癸烯醛、2-十一烯醛是由OA氧化形成的氢过氧化物降解产生的,体系中还检测到(E,E)-2,4-癸二烯醛和2,4-壬二烯醛。未经热氧化处理的OA中未检出ESA,在OA热氧化处理的前25 h时,体系内ESA的含量较低,在热氧化处理的25 h后,ESA的含量显著升高,并且体系中反式ESA的含量高于顺式构型。采用皮尔逊相关系数分析法对自由基与OA氧化产物进行分析推测出ESA的形成规律是烷氧自由基的环化反应,即OA氧化形成的烷基自由基先与氧气反应形成氢过氧化物,然后断裂形成烷氧自由基,最终生成ESA。(3)本文以HepG2细胞为研究对象,探讨了OA及其氧化产物ESA对细胞的毒性作用及氧化损伤。结果表明,高浓度OA诱导的细胞的存活率虽然会降低,但仍保持在57%以上,说明OA对细胞的毒性作用较小。而ESA诱导的细胞存活率随诱导时间和浓度的增加显著降低,500μM ESA诱导48 h的细胞存活率仅为24.41%,说明ESA会对HepG2细胞产生毒性作用。细胞周期实验结果显示ESA诱导的细胞在G0/G1期百分比增加,S期细胞减少,表明ESA抑制细胞增殖是通过将细胞阻断在G0/G1期。细胞凋亡实验进一步阐明了ESA对细胞的毒性作用,结果显示ESA诱导12 h的细胞凋亡主要发生早期,而诱导24 h和48 h的细胞凋亡主要发生晚期,并且ESA诱导的细胞凋亡率与剂量和时间呈依赖性相关。同时考察了OA和ESA对细胞内活性氧水平的影响,结果发现OA不会引起细胞中ROS水平的升高,而ESA诱导12 h和24 h的细胞内ROS含量随ESA浓度的增加显著升高,ESA诱导48 h的细胞内ROS含量相比于对照组也会有所增加,但远低于相同浓度诱导12 h和24 h的细胞。通过检测细胞内脂质过氧化的程度(MDA)及抗氧化能力(SOD、CAT和GSH-Px)发现,OA对细胞内脂质过氧化程度及抗氧化系统影响较小,ESA诱导12 h和24 h的细胞内MDA含量随ESA浓度的增加而显著提高,而抗氧化物酶(SOD、CAT和GSH-Px)含量则呈现出相反的趋势并且ESA诱导48 h的细胞中MDA和抗氧化物酶含量都低于相同浓度下诱导12 h和24h的细胞。通过测定与细胞凋亡相关基因的表达水平进一步说明,OA不会引起细胞内参与细胞凋亡相关基因的大幅度变化,而ESA会促进促凋亡基因Bax的表达并抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,同时还会促进Cyt C基因及下游基因Caspase-9和Caspase-3的表达。因此,ESA会降低HepG2细胞的抗氧化能力并诱导细胞出现氧化损伤,并且明ESA诱导细胞凋亡的方式可能是通过线粒体介导的内源性途径来实现的。(4)本文进一步探讨了OA及其氧化产物ESA对HepG2细胞脂质代谢的影响。结过表明,低浓度OA(10μM-20μM)不会造成细胞内脂肪的堆积,随着OA浓度的增加,细胞内会形成少量的脂滴,并且OA诱导的细胞中TAG和TC含量与对照组相比变化较小,进一步说明OA不会造成细胞内脂肪的大量积累。而ESA诱导的细胞中脂滴的数目、TAG及TC的含量会随诱导时间和浓度的增加而增加。此外,长时间(48 h)OA和ESA诱导的细胞由于营养物质的缺失而使细胞中脂滴的数目、TAG和TC的含量明显低于相同浓度诱导12 h和24 h的细胞。另一方面,OA诱导24 h的细胞中棕榈油酸和OA的含量随诱导浓度的增加而增加,而棕榈酸、硬脂酸以及其他不饱和脂肪酸的含量随诱导浓度的增加而减少,ESA诱导12 h和24 h的细胞中这些脂肪酸的含量与OA诱导的细胞呈现相同的趋势变化,但变化程度远远大于OA诱导的细胞,并且细胞中ESA的含量以剂量和时间依赖性方式增加。对HepG2细胞中参与脂肪酸代谢的相关基因表达的测定结果说明,低浓度OA不会引起细胞中参与脂肪酸代谢相关基因表达水平的改变,而高浓度诱导的细胞中参与脂肪酸合成相关基因Srebp-1c及其下游基因Scd1的表达会有所增加,而参与脂肪酸代谢相关基因PPARα、Cpt1α及Acox1的表达会有所下降。ESA会显著促进细胞中参与脂肪酸合成相关基因Srebp-1c及其下游基因Scd1的表达,同时还会显著抑制PPARα基因及下游基因Cpt1α和Acox1的表达。因此,ESA会促进HepG2细胞中脂肪酸的生成,造成细胞内脂肪的大量堆积,从而改变细胞内正常的脂质代谢过程。