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【目的】
探讨外泌体源性表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)在人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)-16E7诱导的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)细胞上皮一间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)中的作用及其潜在分子机制，为HPV感染相关肺癌及EGFR抑制剂耐药性肺癌的临床治疗提供一定的新思路。
【方法】
1.外泌体提取鉴定：采用超速离心法分别提取过表达HPV-16E7(细胞简称：A549E7、NCI-H460E7)及空载体(细胞简称：A549空载、NCI-H460空载)NSCLC细胞来源的外泌体(外泌体简称：E7Exo和空载Exo)；利用透射电子显微镜观察外泌体形态结构；采用Westernblot检测外泌体相关标志物CD9、CD81、TSGl01及阴性对照Grp94在外泌体中的含量。
2．外泌体在HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、增殖及EMT中的作用：将E7Exo和空载Exo分别加入A549或NCI-H460细胞中处理24h，24h后通过划痕实验、Transwell小室迁移实验分析比较各组细胞迁移能力；采用平板克隆实验分析比较各组细胞增殖能力；采用Westernblot检测EMT相关标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和相关转录因子(Snaill、Slug、Twistl)的蛋白表达情况。
3．采用Westernblot分析HPV-16E7对NSCLC细胞及其外泌体内EGFR、磷酸化EGFR(phospho-EGFR，p-EGFR)和Alix含量的影响。
4．外泌体源性EGFR在HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT中的作用：用EGFR抑制剂(PD168393)、外泌体分泌抑制剂(GW4869)和DMSO(溶剂对照)分别处理A549E7、NCI-H460E7细胞24h，24h后将细胞转移到0.4μm孔径大小的Transwell小室的上室中，与A549或NCI-H460细胞共培养24h。24h后通过Transwell小室迁移、侵袭实验分析比较各组细胞迁移、侵袭能力；采用Westernblot及RT-qPCR检测EGFR、EMT相关标志物的蛋白和mRNA表达情况。
5．采用Westernblot分析外泌体源性EGFR对HPV-16E7癌蛋白诱导的Akt、Erkl/2和Stat3信号通路激活的影响。
6．差异表达microRNA(miRNA)的筛选：通过超速离心法提取A549E7和A549空载细胞来源的外泌体(外泌体简称：A549E7Exo和A549空载Exo)，经Illumina高通量测序仪分析差异表达miRNA。
【结果】
1．所提外泌体在透射电子显微镜下呈现典型的杯口状，而且其均包含CD9、CD81和TSGl01，不包含Grp94，说明成功从各组细胞培养上清液中提取出外泌体。
2．相比于空载Exo处理组，E7Exo处理组显著增强NSCLC细胞的迁移及增殖能力(P＜0.01)；同时E7Exo明显促进EMT间质标志物N-cadherin、Vimentin及转录因子Snaill，Twistl的蛋白表达，抑制EMT上皮标志物E-cadherin的蛋白表达。
3．过表达HPV-16E7的肺癌细胞及其外泌体内EGFR、p-EGFR的蛋白含量均高于空载体细胞及其分泌的外泌体，Alix则出现相反的结果。
4．Westernblot结果显示，相比于溶剂对照组，在抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌EGFR和p-EGFR的蛋白表达均有所下降，而Alix的表达升高；但在mRNA水平上各组细胞间EGFR的表达差异没有显著性(P＞0.05)。
5．相比于溶剂对照组，抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌后，E7Exo诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭能力均明显受到抑制(P＜O.01)，而且在蛋白水平上N-cadherin、Vimentin、Snaill、Slug、Twistl的表达下降，E-cadherin的表达升高，E7Exo诱导的EMT在蛋白水平上被逆转；在mRNA水平上，抑抑制外泌体分泌后显著抑制了HPV-16E7诱导的N-cadherin、VimenentinmRNA在A549及NCI-H460细胞内的表达(P＜0.05)，而抑制外泌体源性EGFR活化则仅抑制了A549细胞内Ⅳ-cadherin和NCI-H460细胞内VimentinmRNA的表达(P＜0.05)，两种抑制剂对E-cadherinmRNA表达抑制的差异没有显著性(P＞0.05)。
6．抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌后，E7Exo诱导的Akt、Erkl/2和Stat3信号通路的激活被抑制。
7．通过高通量测序检测出520种miRNA，差异倍数＞2且P＜0.05的有12种，其7种miRNA(let-7d-5p、miR-lOb-5p、miR-221-3p、miR-30c-2-3p、miR-381-3p、miR-409-3p和miR-5480-3p)在A549E7Exo中上调，5种miRNA(let-7d-3p、miR-101-3p、miR-125b-l-3p、miR-30c-l-3p和miR-30e-3p)下调。
【结论】
外泌体源性EGFR参与调控HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT，其机制可能与EGFR下游Akt、Erkl/2和Stat3信号通路的激活有关，且可能有miR-lOb-5p和miR-221-3p等miRNA的参与。
探讨外泌体源性表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR)在人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)-16E7诱导的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)细胞上皮一间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)中的作用及其潜在分子机制，为HPV感染相关肺癌及EGFR抑制剂耐药性肺癌的临床治疗提供一定的新思路。
【方法】
1.外泌体提取鉴定：采用超速离心法分别提取过表达HPV-16E7(细胞简称：A549E7、NCI-H460E7)及空载体(细胞简称：A549空载、NCI-H460空载)NSCLC细胞来源的外泌体(外泌体简称：E7Exo和空载Exo)；利用透射电子显微镜观察外泌体形态结构；采用Westernblot检测外泌体相关标志物CD9、CD81、TSGl01及阴性对照Grp94在外泌体中的含量。
2．外泌体在HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、增殖及EMT中的作用：将E7Exo和空载Exo分别加入A549或NCI-H460细胞中处理24h，24h后通过划痕实验、Transwell小室迁移实验分析比较各组细胞迁移能力；采用平板克隆实验分析比较各组细胞增殖能力；采用Westernblot检测EMT相关标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和相关转录因子(Snaill、Slug、Twistl)的蛋白表达情况。
3．采用Westernblot分析HPV-16E7对NSCLC细胞及其外泌体内EGFR、磷酸化EGFR(phospho-EGFR，p-EGFR)和Alix含量的影响。
4．外泌体源性EGFR在HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT中的作用：用EGFR抑制剂(PD168393)、外泌体分泌抑制剂(GW4869)和DMSO(溶剂对照)分别处理A549E7、NCI-H460E7细胞24h，24h后将细胞转移到0.4μm孔径大小的Transwell小室的上室中，与A549或NCI-H460细胞共培养24h。24h后通过Transwell小室迁移、侵袭实验分析比较各组细胞迁移、侵袭能力；采用Westernblot及RT-qPCR检测EGFR、EMT相关标志物的蛋白和mRNA表达情况。
5．采用Westernblot分析外泌体源性EGFR对HPV-16E7癌蛋白诱导的Akt、Erkl/2和Stat3信号通路激活的影响。
6．差异表达microRNA(miRNA)的筛选：通过超速离心法提取A549E7和A549空载细胞来源的外泌体(外泌体简称：A549E7Exo和A549空载Exo)，经Illumina高通量测序仪分析差异表达miRNA。
【结果】
1．所提外泌体在透射电子显微镜下呈现典型的杯口状，而且其均包含CD9、CD81和TSGl01，不包含Grp94，说明成功从各组细胞培养上清液中提取出外泌体。
2．相比于空载Exo处理组，E7Exo处理组显著增强NSCLC细胞的迁移及增殖能力(P＜0.01)；同时E7Exo明显促进EMT间质标志物N-cadherin、Vimentin及转录因子Snaill，Twistl的蛋白表达，抑制EMT上皮标志物E-cadherin的蛋白表达。
3．过表达HPV-16E7的肺癌细胞及其外泌体内EGFR、p-EGFR的蛋白含量均高于空载体细胞及其分泌的外泌体，Alix则出现相反的结果。
4．Westernblot结果显示，相比于溶剂对照组，在抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌EGFR和p-EGFR的蛋白表达均有所下降，而Alix的表达升高；但在mRNA水平上各组细胞间EGFR的表达差异没有显著性(P＞0.05)。
5．相比于溶剂对照组，抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌后，E7Exo诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭能力均明显受到抑制(P＜O.01)，而且在蛋白水平上N-cadherin、Vimentin、Snaill、Slug、Twistl的表达下降，E-cadherin的表达升高，E7Exo诱导的EMT在蛋白水平上被逆转；在mRNA水平上，抑抑制外泌体分泌后显著抑制了HPV-16E7诱导的N-cadherin、VimenentinmRNA在A549及NCI-H460细胞内的表达(P＜0.05)，而抑制外泌体源性EGFR活化则仅抑制了A549细胞内Ⅳ-cadherin和NCI-H460细胞内VimentinmRNA的表达(P＜0.05)，两种抑制剂对E-cadherinmRNA表达抑制的差异没有显著性(P＞0.05)。
6．抑制外泌体源性EGFR活化或抑制外泌体分泌后，E7Exo诱导的Akt、Erkl/2和Stat3信号通路的激活被抑制。
7．通过高通量测序检测出520种miRNA，差异倍数＞2且P＜0.05的有12种，其7种miRNA(let-7d-5p、miR-lOb-5p、miR-221-3p、miR-30c-2-3p、miR-381-3p、miR-409-3p和miR-5480-3p)在A549E7Exo中上调，5种miRNA(let-7d-3p、miR-101-3p、miR-125b-l-3p、miR-30c-l-3p和miR-30e-3p)下调。
【结论】
外泌体源性EGFR参与调控HPV-16E7诱导的NSCLC细胞迁移、侵袭及EMT，其机制可能与EGFR下游Akt、Erkl/2和Stat3信号通路的激活有关，且可能有miR-lOb-5p和miR-221-3p等miRNA的参与。