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【目的】
1.从秋海棠科秋海棠属紫背天葵(Begonia fimbristipula Hance，BFH)中提取并分离纯化抗炎、降脂活性成分。
2.对紫背天葵提取物中抗炎降脂活性成分的作用机制进行初步研究。
【方法】
1.紫背天葵成分提取。烘干药材后粉碎，称重器称取1.0kg。水提时采用5L超纯水常温浸润24h，超声波50KHz处理1h，90℃冷凝回流提取两次，95%乙醇4℃沉淀24h，过滤旋干；醇提时采用5L95%乙醇常温浸润2h，超声波50KHz处理1h，75℃冷凝回流提取两次，过滤旋干。
2.紫背天葵提取物的分离纯化及结构鉴定。对紫背天葵醇提物的活性部位采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析、重结晶、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)等方法进行化学成分分离纯化，应用核磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance，13C-NMR)对分离得到的化合物进行结构鉴定。
3.紫背天葵提取物的细胞毒性分析。实验设置空白组、对照组、药物组。人单核THP-1细胞用1μg/mL佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)作用48h，诱导其分化贴壁。药物组加入不同浓度梯度的紫背天葵提取药液作用24h，空白组和对照组加入RPMI1640培养基，镜下观察细胞状态。每孔加入含10%CCK8的RPMI1640培养基作用1～2h，酶标仪450nm波长处读吸光度值，并计算细胞存活率。选取细胞存活率大于90%的最大药物浓度作为该药的最高无毒浓度(maximal atoxic concentration，TC0)。
4.紫背天葵提取物的抗炎活性分析。实验分为PMA组、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)组、药物组、阳性对照吲哚美辛(indometacin，INDO)组。1μg/mLPMA工作液浓度诱导人单核THP-1悬浮细胞分化为巨噬贴壁细胞48h后，用1μg/mLLPS处理巨噬细胞24h后诱导为炎症细胞。随后药物组给予紫背天葵不同提取成分药液作用24h，收集细胞上清液，ELISA法检测肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactorα，TNF-α)表达水平。随后IP细胞裂解液充分裂解细胞，GriessReagent法分别测定PMA组、LPS组、药物组、阳性对照INDO组中NO含量。WesternBlot分析各组iNOS和NF-κBp65蛋白水平。
5.紫背天葵提取物的降脂活性分析。实验分为乙酰化低密度脂蛋白(acetylated-low density lipoprotein，ac-LDL)组、载脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1， apoA-1)组、药物组、阳性对照辛伐他汀(simvastatin，SV)组。1μg/mLPMA将THP-1单核悬浮细胞分化为巨噬贴壁细胞后，用50μg/mLac-LDL处理贴壁THP-1细胞诱导成为泡沫细胞(ac-LDL组)，加入10μg/mLapoA-1作用12h(apoA-1组)，药物组在apoA-1组基础上给予紫背天葵不同提取成分药液作用12h。WesternBlot分析不同处理组中ADFP和ABCA1蛋白表达量的变化。液体闪烁计数法检测不同处理细胞的胆固醇流出率。胆固醇流出率%=培养基内放射强度/(细胞内放射强度+培养基内放射强度)×100%。
【结果】
1.紫背天葵通过超纯水和95%乙醇浸润、超声处理、冷凝回流、减压抽滤、旋转蒸发、烘干等传统药物提取方法，获得紫背天葵水提物(aqueous extraction of Begonia fimbristipula Hance，BFHAE)和紫背天葵醇提物(ethanol extraction of Begonia fimbristipula Hance，BFHEE)。
2.紫背天葵醇提物通过正己烷(normal hexane ， Hex )、二氯甲烷(dichloromethane，DCM)、乙酸乙酯(ethyl aucetate，EAC)、正丁醇(normal butanol ， NBA )4种溶剂萃取，分别浓缩后获得BFHEE-Hex、BFHEE-DCM、BFHEE-EAC、BFHEE-NBA四个组分，将BFHEE-DCM组分通过硅胶层析、凝胶柱层析、重结晶获得BFHEE-DCM1～5五段组分。将BFHEE-DCM1组分通过HPLC分离纯化获得相对单一组分BFHEE-DCM1.1。对BFHEE-DCM1.1应用13C-NMR对其结构进行鉴定，得到一种化合物为十六烷酸。
3.CCK8实验结果显示，不同提取组分的紫背天葵药液作用于经PMA诱导的THP-1细胞24h，与正常细胞对照组(PMA组)相比，BFHAE组、BFHEE组细胞存活率高于90%的TC0为100μg/mL；BFHEE-Hex组、BFHEE-DCM组、BFHEE-EAC组、BFHEE-NBA组和BFHEE-DCM1～5组TC0均为50μg/mL；BFHEE-DCM1.1组TC0为30μg/mL。同时，上述浓度作用下的THP-1细胞，在镜下观察均未表现出毒性反应。
4.与LPS组相比，BFHAE组对NO、TNF-α炎症介质并无明显抑制作用。但BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组与LPS组相比对NO有抑制作用，分别降低47%、46%、33%、58%、68%、55%、15%，差异具有统计学意义(P＜0.001)；与LPS组相比，BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM2、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组对TNF-α有抑制作用，分别降低46%、53%、27%、59%、75%、30%、8%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
5.WesternBlot结果分析显示，与LPS组相比，BFHAE组对iNOS、p65蛋白表达无明显影响，而BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1药物组(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)对p65蛋白表达量有下调作用，分别下调60%，56%、24%、11%、9%、32%(P＜0.001)；BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组对iNOS蛋白表达有下调作用，分别下调80%、21%、18%、29%、48%、34%、46%(P＜0.01)。
6.胆固醇流出率结果显示，与ac-LDL组相比，经apoA-1处理的泡沫细胞胆固醇流出率提高63.6%(P＜0.001)，表明apoA-1参与介导了泡沫细胞内胆固醇流出。与apoA-1组相比，BFHEE组胆固醇流出率上调26%、BFHEE-DCM组胆固醇流出率上调24%、BFHEE-DCM1组和BFHEE-DCM1.1(30μg/mL)组胆固醇流出率分别上调34%和78%(P＜0.001)。
7.WesternBlot结果分析显示，与ac-LDL组相比，apoA-1处理的泡沫细胞ADFP蛋白表达量下调24%，ABCA1蛋白表达量上调68%，差异具有统计学意义(P＜0.001)。与apoA-1组相比，BFHAE组对ADFP、ABCA1蛋白表达量无明显影响，而BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-EAC、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM5、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL)药物组中对ADFP蛋白表达有下调作用，分别下调54%、26%、16%、19%、28%、57%、38%、32%，差异具有统计学意义(P＜0.001)，BFHEE-DCM1.1(10μg/mL)组中ADFP蛋白相对表达量与apoA-1组无明显差异。BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)组中对ABCA1蛋白表达量有上调作用，分别上调22%、23%、17%、36%、20%、22%，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
【结论】
1.紫背天葵提取物中BFHEE-DCM1.1具有抗炎、降脂活性。经HPLC分离、13C-NMR结构鉴定出十六烷酸化合物。
2.BFHEE-DCM1.1可显著抑制LPS处理的THP-1炎症细胞中NO、TNF-α的分泌以及iNOS、p65蛋白量的表达，初步推测紫背天葵发挥抗炎作用机制与抑制NF-κB信号通路有关。
3.BFHEE-DCM1.1可显著提高apoA-1介导的THP-1泡沫细胞中胆固醇流出率，泡沫细胞ABCA1蛋白表达增强、ADFP蛋白表达降低，初步推测紫背天葵发挥降脂作用与激活胆固醇逆向转运有关。
1.从秋海棠科秋海棠属紫背天葵(Begonia fimbristipula Hance，BFH)中提取并分离纯化抗炎、降脂活性成分。
2.对紫背天葵提取物中抗炎降脂活性成分的作用机制进行初步研究。
【方法】
1.紫背天葵成分提取。烘干药材后粉碎，称重器称取1.0kg。水提时采用5L超纯水常温浸润24h，超声波50KHz处理1h，90℃冷凝回流提取两次，95%乙醇4℃沉淀24h，过滤旋干；醇提时采用5L95%乙醇常温浸润2h，超声波50KHz处理1h，75℃冷凝回流提取两次，过滤旋干。
2.紫背天葵提取物的分离纯化及结构鉴定。对紫背天葵醇提物的活性部位采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析、重结晶、高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)等方法进行化学成分分离纯化，应用核磁共振碳谱(13C nuclear magnetic resonance，13C-NMR)对分离得到的化合物进行结构鉴定。
3.紫背天葵提取物的细胞毒性分析。实验设置空白组、对照组、药物组。人单核THP-1细胞用1μg/mL佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)作用48h，诱导其分化贴壁。药物组加入不同浓度梯度的紫背天葵提取药液作用24h，空白组和对照组加入RPMI1640培养基，镜下观察细胞状态。每孔加入含10%CCK8的RPMI1640培养基作用1～2h，酶标仪450nm波长处读吸光度值，并计算细胞存活率。选取细胞存活率大于90%的最大药物浓度作为该药的最高无毒浓度(maximal atoxic concentration，TC0)。
4.紫背天葵提取物的抗炎活性分析。实验分为PMA组、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)组、药物组、阳性对照吲哚美辛(indometacin，INDO)组。1μg/mLPMA工作液浓度诱导人单核THP-1悬浮细胞分化为巨噬贴壁细胞48h后，用1μg/mLLPS处理巨噬细胞24h后诱导为炎症细胞。随后药物组给予紫背天葵不同提取成分药液作用24h，收集细胞上清液，ELISA法检测肿瘤坏死因子(tumournecrosisfactorα，TNF-α)表达水平。随后IP细胞裂解液充分裂解细胞，GriessReagent法分别测定PMA组、LPS组、药物组、阳性对照INDO组中NO含量。WesternBlot分析各组iNOS和NF-κBp65蛋白水平。
5.紫背天葵提取物的降脂活性分析。实验分为乙酰化低密度脂蛋白(acetylated-low density lipoprotein，ac-LDL)组、载脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1， apoA-1)组、药物组、阳性对照辛伐他汀(simvastatin，SV)组。1μg/mLPMA将THP-1单核悬浮细胞分化为巨噬贴壁细胞后，用50μg/mLac-LDL处理贴壁THP-1细胞诱导成为泡沫细胞(ac-LDL组)，加入10μg/mLapoA-1作用12h(apoA-1组)，药物组在apoA-1组基础上给予紫背天葵不同提取成分药液作用12h。WesternBlot分析不同处理组中ADFP和ABCA1蛋白表达量的变化。液体闪烁计数法检测不同处理细胞的胆固醇流出率。胆固醇流出率%=培养基内放射强度/(细胞内放射强度+培养基内放射强度)×100%。
【结果】
1.紫背天葵通过超纯水和95%乙醇浸润、超声处理、冷凝回流、减压抽滤、旋转蒸发、烘干等传统药物提取方法，获得紫背天葵水提物(aqueous extraction of Begonia fimbristipula Hance，BFHAE)和紫背天葵醇提物(ethanol extraction of Begonia fimbristipula Hance，BFHEE)。
2.紫背天葵醇提物通过正己烷(normal hexane ， Hex )、二氯甲烷(dichloromethane，DCM)、乙酸乙酯(ethyl aucetate，EAC)、正丁醇(normal butanol ， NBA )4种溶剂萃取，分别浓缩后获得BFHEE-Hex、BFHEE-DCM、BFHEE-EAC、BFHEE-NBA四个组分，将BFHEE-DCM组分通过硅胶层析、凝胶柱层析、重结晶获得BFHEE-DCM1～5五段组分。将BFHEE-DCM1组分通过HPLC分离纯化获得相对单一组分BFHEE-DCM1.1。对BFHEE-DCM1.1应用13C-NMR对其结构进行鉴定，得到一种化合物为十六烷酸。
3.CCK8实验结果显示，不同提取组分的紫背天葵药液作用于经PMA诱导的THP-1细胞24h，与正常细胞对照组(PMA组)相比，BFHAE组、BFHEE组细胞存活率高于90%的TC0为100μg/mL；BFHEE-Hex组、BFHEE-DCM组、BFHEE-EAC组、BFHEE-NBA组和BFHEE-DCM1～5组TC0均为50μg/mL；BFHEE-DCM1.1组TC0为30μg/mL。同时，上述浓度作用下的THP-1细胞，在镜下观察均未表现出毒性反应。
4.与LPS组相比，BFHAE组对NO、TNF-α炎症介质并无明显抑制作用。但BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组与LPS组相比对NO有抑制作用，分别降低47%、46%、33%、58%、68%、55%、15%，差异具有统计学意义(P＜0.001)；与LPS组相比，BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM2、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组对TNF-α有抑制作用，分别降低46%、53%、27%、59%、75%、30%、8%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。
5.WesternBlot结果分析显示，与LPS组相比，BFHAE组对iNOS、p65蛋白表达无明显影响，而BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1药物组(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)对p65蛋白表达量有下调作用，分别下调60%，56%、24%、11%、9%、32%(P＜0.001)；BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)药物组对iNOS蛋白表达有下调作用，分别下调80%、21%、18%、29%、48%、34%、46%(P＜0.01)。
6.胆固醇流出率结果显示，与ac-LDL组相比，经apoA-1处理的泡沫细胞胆固醇流出率提高63.6%(P＜0.001)，表明apoA-1参与介导了泡沫细胞内胆固醇流出。与apoA-1组相比，BFHEE组胆固醇流出率上调26%、BFHEE-DCM组胆固醇流出率上调24%、BFHEE-DCM1组和BFHEE-DCM1.1(30μg/mL)组胆固醇流出率分别上调34%和78%(P＜0.001)。
7.WesternBlot结果分析显示，与ac-LDL组相比，apoA-1处理的泡沫细胞ADFP蛋白表达量下调24%，ABCA1蛋白表达量上调68%，差异具有统计学意义(P＜0.001)。与apoA-1组相比，BFHAE组对ADFP、ABCA1蛋白表达量无明显影响，而BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-EAC、BFHEE-NBA、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM5、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL)药物组中对ADFP蛋白表达有下调作用，分别下调54%、26%、16%、19%、28%、57%、38%、32%，差异具有统计学意义(P＜0.001)，BFHEE-DCM1.1(10μg/mL)组中ADFP蛋白相对表达量与apoA-1组无明显差异。BFHEE、BFHEE-DCM、BFHEE-DCM1、BFHEE-DCM1.1(30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL)组中对ABCA1蛋白表达量有上调作用，分别上调22%、23%、17%、36%、20%、22%，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
【结论】
1.紫背天葵提取物中BFHEE-DCM1.1具有抗炎、降脂活性。经HPLC分离、13C-NMR结构鉴定出十六烷酸化合物。
2.BFHEE-DCM1.1可显著抑制LPS处理的THP-1炎症细胞中NO、TNF-α的分泌以及iNOS、p65蛋白量的表达，初步推测紫背天葵发挥抗炎作用机制与抑制NF-κB信号通路有关。
3.BFHEE-DCM1.1可显著提高apoA-1介导的THP-1泡沫细胞中胆固醇流出率，泡沫细胞ABCA1蛋白表达增强、ADFP蛋白表达降低，初步推测紫背天葵发挥降脂作用与激活胆固醇逆向转运有关。