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【目的】
当前，肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，而肿瘤转移被认为是导致肺癌治疗难度大、预后差和死亡率高的首要原因。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)作为人体必需脂肪酸omega-3中的重要成员，具有广泛的抗肿瘤效应，其作用机制包括对微小RNA(MicroRNA, miRNA)的表达调控。早期，我们通过对公共数据库中肺癌miRNA芯片信息进行统计分析，发现miR-26a在肺癌组织和肺癌患者外周血中明显低表达。在此基础上，本文拟通过体外实验，深入探索DHA靶向调控miR-26a表达对NSCLC细胞迁移侵袭的作用及其机制，旨在为肺癌患者开展营养干预治疗提供新的靶点及研究方向。
【方法】
1.采用划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验法检测DHA对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，采用RT-qPCR和Westernblot法分别检测DHA对肿瘤细胞中迁移侵袭相关基因及miR-26a的表达水平影响。
2.利用公共数据库中肺癌miRNA芯片数据和实验室肺癌细胞系样品，分析miR-26a在肺癌细胞中的表达差异。通过Targetscan网站预测miR-26a的靶基因，并从中筛选出评分较高的靶基因EZH2，采用双荧光素酶报告基因实验、Westernblot法验证miR-26a的预测靶点。通过RT-qPCR、Westernblot实验检测DHA处理后NSCLC细胞中EZH2基因和蛋白的表达变化。
3.采用划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验法，体外观察miR-26a处理、DHA联合miRNA-26a处理对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，并采用RT-qPCR、Westernblot实验检测EZH2及迁移侵袭相关基因mRNA和蛋白表达变化。
4.构建过表达EZH2质粒载体，采用Transwell小室迁移和侵袭实验和Westernblot法检测EZH2质粒联合miR-26amimic共转染、EZH2质粒转染联合DHA处理条件下对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，进一步研究DHA通过miR-26a抑制NSCLC细胞迁移侵袭的分子机制。
【结果】
1.通过划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验发现60μmol/L浓度的DHA显著抑制肺癌细胞的迁移及侵袭能力；同时RT-qPCR和Westernblot结果显示N-Cadherin、Vimentin、Twist1基因及蛋白表达水平明显降低，E-Cadherin基因及蛋白表达水平明显升高。浓度为60μmol/L的DHA处理后能显著上调NSCLC细胞中miR-26a的表达。
2.通过公共数据库芯片结果分析，我们发现miR-26a在肺癌患者的肺癌组织及外周血中明显低表达。相比于正常肺上皮细胞，miR-26a在肺癌细胞系中低表达。wt-EZH23?UTR双荧光素酶质粒与miR-26amimic共转染A549细胞后，我们检测到荧光素酶活性显著下降，证实了EZH2是miR-26a的作用靶点；且miR-26a抑制了NSCLC细胞EZH2蛋白的表达。此外，RT-qPCR实验和Westernblot实验结果显示60μmol/L浓度的DHA降低了NSCLC细胞中EZH2基因及蛋白的表达。
3.通过划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验发现miR-26amimic能够协同增强DHA抑制NSCLC细胞迁移侵袭的作用；进一步对转移相关基因的检测发现DHA联合miRNA-26amimic有效抑制了细胞N-Cadherin、Vimentin、EZH2的表达，但促进了E-Cadherin的表达；与此相反，miR-26ainhibitor转染NSCLC细胞后，能够逆转DHA对NSCLC细胞迁移侵袭的抑制作用。
4.EZH2过表达质粒转染NSCLC细胞后，逆转DHA和miR-26a对NSCLC细胞迁移侵袭的抑制；进一步的机制研究显示过表达EZH2促进了N-Cadherin、Vimentin和EZH2的蛋白表达，而E-Cadherin的蛋白表达明显下降。
【结论】
miR-26a在NSCLC组织和细胞株中明显低表达，60μmol/L浓度的DHA能通过上调miR-26a的表达有效地抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力，其作用机制涉及对miR-26a靶基因EZH2的表达抑制。
当前，肺癌是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，而肿瘤转移被认为是导致肺癌治疗难度大、预后差和死亡率高的首要原因。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)作为人体必需脂肪酸omega-3中的重要成员，具有广泛的抗肿瘤效应，其作用机制包括对微小RNA(MicroRNA, miRNA)的表达调控。早期，我们通过对公共数据库中肺癌miRNA芯片信息进行统计分析，发现miR-26a在肺癌组织和肺癌患者外周血中明显低表达。在此基础上，本文拟通过体外实验，深入探索DHA靶向调控miR-26a表达对NSCLC细胞迁移侵袭的作用及其机制，旨在为肺癌患者开展营养干预治疗提供新的靶点及研究方向。
【方法】
1.采用划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验法检测DHA对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，采用RT-qPCR和Westernblot法分别检测DHA对肿瘤细胞中迁移侵袭相关基因及miR-26a的表达水平影响。
2.利用公共数据库中肺癌miRNA芯片数据和实验室肺癌细胞系样品，分析miR-26a在肺癌细胞中的表达差异。通过Targetscan网站预测miR-26a的靶基因，并从中筛选出评分较高的靶基因EZH2，采用双荧光素酶报告基因实验、Westernblot法验证miR-26a的预测靶点。通过RT-qPCR、Westernblot实验检测DHA处理后NSCLC细胞中EZH2基因和蛋白的表达变化。
3.采用划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验法，体外观察miR-26a处理、DHA联合miRNA-26a处理对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，并采用RT-qPCR、Westernblot实验检测EZH2及迁移侵袭相关基因mRNA和蛋白表达变化。
4.构建过表达EZH2质粒载体，采用Transwell小室迁移和侵袭实验和Westernblot法检测EZH2质粒联合miR-26amimic共转染、EZH2质粒转染联合DHA处理条件下对NSCLC细胞迁移侵袭能力的影响，进一步研究DHA通过miR-26a抑制NSCLC细胞迁移侵袭的分子机制。
【结果】
1.通过划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验发现60μmol/L浓度的DHA显著抑制肺癌细胞的迁移及侵袭能力；同时RT-qPCR和Westernblot结果显示N-Cadherin、Vimentin、Twist1基因及蛋白表达水平明显降低，E-Cadherin基因及蛋白表达水平明显升高。浓度为60μmol/L的DHA处理后能显著上调NSCLC细胞中miR-26a的表达。
2.通过公共数据库芯片结果分析，我们发现miR-26a在肺癌患者的肺癌组织及外周血中明显低表达。相比于正常肺上皮细胞，miR-26a在肺癌细胞系中低表达。wt-EZH23?UTR双荧光素酶质粒与miR-26amimic共转染A549细胞后，我们检测到荧光素酶活性显著下降，证实了EZH2是miR-26a的作用靶点；且miR-26a抑制了NSCLC细胞EZH2蛋白的表达。此外，RT-qPCR实验和Westernblot实验结果显示60μmol/L浓度的DHA降低了NSCLC细胞中EZH2基因及蛋白的表达。
3.通过划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验发现miR-26amimic能够协同增强DHA抑制NSCLC细胞迁移侵袭的作用；进一步对转移相关基因的检测发现DHA联合miRNA-26amimic有效抑制了细胞N-Cadherin、Vimentin、EZH2的表达，但促进了E-Cadherin的表达；与此相反，miR-26ainhibitor转染NSCLC细胞后，能够逆转DHA对NSCLC细胞迁移侵袭的抑制作用。
4.EZH2过表达质粒转染NSCLC细胞后，逆转DHA和miR-26a对NSCLC细胞迁移侵袭的抑制；进一步的机制研究显示过表达EZH2促进了N-Cadherin、Vimentin和EZH2的蛋白表达，而E-Cadherin的蛋白表达明显下降。
【结论】
miR-26a在NSCLC组织和细胞株中明显低表达，60μmol/L浓度的DHA能通过上调miR-26a的表达有效地抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力，其作用机制涉及对miR-26a靶基因EZH2的表达抑制。