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[研究背景]非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）是最常见的肺癌类型,约占所有肺癌的85%,病情隐匿,早期表现并不明显甚或无症状,多数患者发现时都已出现局部侵袭和转移,无法进行手术切除。在我国,中医药已经被广泛接受作为NSCLC的补充和替代疗法,可以有效控制肿瘤大小、改善临床症状、提高生活质量及延长生存期。养肺方作为全国名老中医王沛教授治疗NSCLC的经验方,长期临床运用确有疗效,能显著提高患者生活质量、有效延长生存期、提高患者体力,但其具体的作用机制尚不明确,值得进一步研究。[研究目的]1.采用网络药理学的研究方法,初步筛选分析养肺方对非小细胞肺癌作用的有效成分及可能的作用机制。2.设计体外实验,探索养肺方对非小细胞肺癌增殖与侵袭的作用,并初步验证网络药理学筛选到的作用通路,探究养肺方治疗非小细胞肺癌分子机制,以期为临床应用养肺方治疗非小细胞肺癌提供科学依据。[研究方法]1.基于BATMAN-TCM、TCMSP两个数据库收集养肺方11味组成中药的有效成分及作用靶点;利用Genecards、OMIM、CTD数据平台,获取“非小细胞肺癌”的关键靶基因,将药物作用靶点映射到疾病靶基因上,获取交集基因;利用String平台建立蛋白互作网络（PPI）;利用Cytoscape软件建立养肺方有效成分-疾病靶点可视化网络图;利用R软件对交集基因进行GO和KEGG富集分析,筛选可能作用的通路途径。研究发现MAPK/ERK信号通路是养肺方抗非小细胞肺癌的核心通路之一。2.使用Wistar大鼠制备养肺方含药血清;选取PC9肺腺癌细胞株,用不同浓度的养肺方含药血清干预,通过CCK8法检测养肺方对PC9细胞增殖能力的影响,并探索养肺方抑制肺腺癌PC9细胞的最佳作用条件,计算抑制率。基于网络药理学研究结果,探究养肺方对PC9细胞MAPK/ERK信号通路及通路核心基因KRAS的影响:运用细胞转染技术构建过表达KRAS及敲降KRAS的PC9细胞株,实验分为6组:空白对照组、含药血清组、过表达质粒组、过表达质粒+含药血清组、siRNA干扰组、siRNA干扰+含药血清组;运用Transwell实验进行细胞侵袭能力分析,运用实时荧光定量法（qRt-PCR）、免疫印迹杂交（western blot）法测定各组中上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）和MAPK/ERK通路关键分子的mRNA及蛋白表达水平;初步验证养肺方通过MAPK/ERK通路抑制非小细胞肺癌增殖、侵袭。[研究结果]1.养肺方治疗非小细胞肺癌的调控网络共有11味中药,107个有效成分,141个药物疾病交集靶点,度值前5的有效成分及交集靶点分别为槲皮素、木犀草素、β-谷固醇、山柰酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮和PTGS2、PTGS1、ADRB2、RXRA、AR;KEGG富集分析涉及到 P53、TNF、MAPK、PI3K/AKT、VEGF、RAS、IL17、HIF-1 等信号通路。2.CCK8实验发现养肺方能够抑制PC9细胞的增殖,各组细胞生存率与空白对照组比较均有统计学差异,10%含药血清对细胞的增殖抑制效果最好;选用10%含药血清分24 h、48 h、72 h干预PC9细胞观察药物的时间效应,发现24 h养肺方作用效果最佳,差异有统计学意义。3.Transwell实验结果显示养肺方能抑制PC9细胞侵袭,过表达KRAS细胞株增强了侵袭能力,加用养肺方干预能逆转KRAS过表达的影响,明显降低肿瘤细胞侵袭能力,敲降KRAS抑制细胞侵袭能力,效果略优于养肺方干预正常PC9细胞。4.用qRt-PCR及western blot技术检测EMT相关基因mRNA及蛋白表达水平。结果显示养肺方干预可以升高E-cadherinmRNA和蛋白表达量,降低N-cadherinmRNA和蛋白表达量,结果与siRNA干扰组相似。与过表达KRAS细胞株相比,加用养肺方干预能逆转KRAS过表达导致的E-cadherin表达降低,N-cadherin表达升高。5.用qRt-PCR及western blot技术检测MAPK/ERK通路相关基因mRNA及蛋白表达水平。结果显示养肺方干预降低KRAS mRNA和蛋白表达量,并影响下游RAF1、MEK1、ERK1/2蛋白磷酸化,结果与siRNA干扰组相似。与过表达KRAS细胞株相比,加用养肺方干预能逆转KRAS过表达导致的下游蛋白RAF1、MEK1、ERK1/2磷酸化水平升高。[研究结论]1.养肺方通过多靶点、多通路抗非小细胞肺癌,MAPK/ERK信号通路是核心通路之一。2.养肺方可以抑制肺腺癌PC9细胞的增殖及侵袭。3.KRAS作为MAPK/ERK通路的关键分子,KRAS表达量的升高激活通路下游蛋白的磷酸化并且可以促进EMT过程。4.养肺方抑制KRAS基因mRNA及蛋白表达,从而抑制MAPK/ERK信号通路,抑制细胞侵袭,发挥抗非小细胞肺癌作用。