【摘 要】
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开花标志着植物成功转向生殖生长,保证了植物的成功繁殖和农作物的产量形成,作物不同品种的开花特性决定了其适宜种植的区域。在陆生植物的地上部分覆盖了角质层作为保护屏障,位于角质层最外层的蜡质赋予了植物抵抗非生物、生物胁迫的能力。本研究包含2个方面的内容,其一是利用对光周期敏感性不同的双亲构建BZ-DH群体进行开花期QTL的定位,并结合节律性转录组测序,对QTL区间内的候选基因进行预测。其二是利用EMS
【基金项目】
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国家自然科学基金（31671722）；
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开花标志着植物成功转向生殖生长,保证了植物的成功繁殖和农作物的产量形成,作物不同品种的开花特性决定了其适宜种植的区域。在陆生植物的地上部分覆盖了角质层作为保护屏障,位于角质层最外层的蜡质赋予了植物抵抗非生物、生物胁迫的能力。本研究包含2个方面的内容,其一是利用对光周期敏感性不同的双亲构建BZ-DH群体进行开花期QTL的定位,并结合节律性转录组测序,对QTL区间内的候选基因进行预测。其二是利用EMS诱变产生的蜡质缺失突变体zgl与正常材料构建分离群体,对A09和C05染色体上蜡质相关的基因进行定位和克隆,并通过转基因互补和基因编辑验证BnaKCS5s是目标基因。主要研究结果如下:1甘蓝型油菜开花期的QTL定位和候选基因分析1.1 BZ-DH群体的开花期QTL分析对BZ-DH群体的遗传连锁图谱重新构建,并结合群体在6个环境下的开花期数据,鉴定到14个开花期QTL。经QTL元分析后获得5个一致性QTL,其中cqFT.A03-1仅在属于半冬性油菜区的4个环境下被检测到,cqFT.C08-1在6个环境下均被检测到。1.2亲本转录组数据的分析在24小时内对亲本间隔4h取样7次进行转录组测序。对至少在一个时间点差异表达的11,888个基因进行GO富集分析,获得123个显著富集且有代表性的条目。对11,888个差异表达基因（DEGs）进行KEGG富集分析,获得36个显著富集的途径,其中植物激素信号转导和植物昼夜节律途径是与开花调控最相关的。1.3开花相关差异表达基因的分析在DEGs中,与开花相关的基因有175个,它们大部分参与了光周期途径。由这些基因的表达模式分析,发现基因在材料间的表达模式存在差异,同一材料中旁系同源基因间的表达模式也存在差异。1.4 QTL区间内候选基因的分析QTL区间内有4个开花期候选基因,其中3个是拟南芥中EMF1（EMBRYONIC FLOWER 1）、NF-YA1（NUCLEARFACTOR Y,SUBUNITA1）和 COL9（CONSTANS-LIKE 9）的同源基因,它们均作为负调控因子参与光周期途径的开花调控,另一个基因在拟南芥中被注释为PHD finger蛋白,可能与FLC基因的染色质修饰有关。本研究揭示了甘蓝型油菜开花期的遗传结构,为该性状的遗传改良奠定了基础。构建的基因节律性表达谱,为基因的动态表达调控及旁系同源基因的功能分化研究提供了数据支持。2甘蓝型油菜蜡质相关基因BnaZGLs的定位和克隆2.1 zgl突变体的表型分析光叶突变体zgl与正常材料7-567相比,表皮不能正常积累蜡质,导致其叶片、茎、角果等部位表面光滑,呈现亮绿色。冷冻扫描电镜对叶片和茎进行观察,发现相比于正常材料,zgl的表皮蜡质晶体严重缺失。叶片的通透性和失水率检测结果显示,zgl与EMS诱变前的材料中双11相比,叶片表皮通透性变强,失水率变大。2.2蜡质相关基因BnaZGLs的定位和克隆通过zgl突变体的遗传模式分析,发现光叶性状是由两对核基因控制的隐性性状。利用分离群体将BnaC05.ZGL和BnaA0R.ZGL基因分别定位在326.6 kb和1.23 Mb的区间内。在C05和A09染色体各自的区间内,分别只有1个基因与光叶表型相关,且这2个基因与拟南芥中的缩合酶KCS5是同源基因。从zgl和7-567中克隆这2个基因,并进行序列分析,发现这2个基因分别在FAE1CUT1RppA结构域的不同保守位点,因单碱基的转换导致了保守氨基酸的改变。2.3BnaC05.ZGL和BnaA09.ZGL基因的表达模式分析利用qRT-PCR检测这2个基因在油菜8个部位的表达情况,发现它们除了在根中表达量很低外,在其余部位均表达量较高,特别是在叶片中,且在所有部位均是BnaA09.ZGL的表达量高于BnaC05.ZGL,该结果与ZS11表达数据库中的结果一致。2.4 BnaZGLs的功能验证通过BnaC05.ZGL的转基因互补获得了一棵表型恢复的阳性植株,利用CRISPR/Cas9技术将这2个基因同时敲除,发现BnaZGLs的4个等位基因同时突变会出现与zgl一样的光叶表型,进一步验证BnaKCS5s是本研究的目标基因。本研究定位克隆了蜡质相关基因BnaZGLs,为BnaZGLs基因的功能研究创建了材料,为甘蓝型油菜蜡质合成通路的研究奠定了基础。
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