棉花纤维是一种由胚珠外表皮细胞分化而成的特殊的单细胞表皮毛,是衣、被主要原料,同时也是造纸、纺织业的重要原材料。棉花纤维细胞壁的特性决定了棉纤维品质,细胞壁蛋白及膜蛋白在纤维发育的过程中起到了重要的作用。解析细胞壁蛋白的结构有助于理解细胞壁的功能,进而阐明棉纤维发育的分子机制。棉纤维的发育分为纤维起始期、纤维伸长期、初生壁向次生壁转换期、次生壁合成期和脱水成熟期共五个时期。Expansin是在纤维伸长期优势表达的基因,它编码一类细胞壁松弛蛋白,通过打破细胞壁多糖之间的非共价键使细胞壁松弛,在酸性条件下能够诱导细胞壁不可逆的伸展。本实验室已有研究表明过表达海岛棉Expansin蛋白基因GbEXPATR的转基因陆地棉,其纤维变长变细变强,但其作用分子机制还未彻底解析。纤维素是陆地上最丰富的大分子生物聚合物,它由葡萄糖分子以β-1,4-糖苷键聚合而成,同时也是成熟棉纤维的主要成分。纤维素合酶复合体（CSC）负责合成纤维素微纤丝并将其分泌到细胞壁中,研究表明,CSC呈“玫瑰花环”结构定位于细胞质膜,它由多个纤维素合酶（CesA）亚基组装而成。尽管在对CesA的功能研究中取得了一系列的进展,但棉花CesA的结构及其催化纤维素合成的机制仍不清晰。本研究围绕棉花中Expansin与CesA的结构与功能展开,主要取得了以下进展:1、建立了毕赤酵母与昆虫细胞2套真核分泌表达的体系。Expansin蛋白是细胞壁蛋白,其本质是分泌蛋白,为了能表达出具有正确折叠和翻译后修饰的Expansin蛋白,以GFP蛋白为正对照,通过改造载体、优化表达条件及纯化方式成功将GFP蛋白分泌出胞外并纯化成功,为体外分泌表达Expansin创造了条件。2、通过昆虫细胞分泌表达的方式筛选并纯化出了高浓度高纯度的GbEXLA1并成功获得了高分辨率的晶体。通过密码子优化并筛选70个海岛棉中GbEXPATR的同源蛋白,获得了一个表达量及纯度都很高的蛋白GbEXLA1。通过缓冲液的优化,经过阳离子交换及分子筛两步纯化,使其可溶性及蛋白性质得到了改善并成功结晶。一共筛选了约1400个条件,在PEG3350以及Tacsimate为结晶条件时,解析了分辨率为2.8（?）的GbEXLA1晶体结构并通过体外多糖水解的生化实验证明了GbEXLA1不具有多糖水解酶的活性。3、通过单颗粒冷冻电镜技术解析了GhCesA7同源三聚体结构。首先对陆地棉中所有CesA成员进行表达筛选,成功筛选到一个表达量较高的蛋白GhCesA7,通过pH缓冲体系的优化、去垢剂的优化、蛋白截短体的优化以及冷冻电镜制样条件的优化,获得了可用于300 k V冷冻电镜数据收集的样品。5116张照片中的2,715,441个单颗粒用于进行2维分类,随后选择2,245,002个单颗粒进行3维重构以及模型搭建,最后解析了分辨率为3.5（?）的GhCesA7同源三聚体结构。4、GhCesA7的结构分析和生化验证。在GhCesA7同源三聚体结构中,每个单体内都可以看到一段β-1,4-葡聚糖链。GhCesA7的跨膜结构域TM1-TM6形成的内部空腔构成了多糖转运的通道,IF1-IF3的螺旋可能共同形成了该通道的入口。生化实验表明,第540位天冬氨酸、第742位天冬氨酸和第784位色氨酸是GhCesA7具备活性必需的氨基酸。通过序列比对可以发现这些活性位点在真核和原核生物中都很保守,说明真核和原核生物很有可能共用一套催化机制。GhCesA7三聚体的构象主要是由PCR结构域和TM7来稳定,而PCR结构域在真核生物的CesA中也较为保守,由此推测植物中CesA不仅可以形成同源三聚体,也可以形成异源三聚体。这一系列结果为GbEXLA1的晶体结构解析打下了扎实的基础,同时GhCesA7同源三聚体结构的成功解析为纤维素合成机理的研究提供了重要的结构依据,为深入研究棉纤维发育的分子机制奠定了一定的基础。