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沙门氏菌是人畜共患病中常见的病原菌之一,对公共卫生和畜牧业的发展构成严重危害。近年来,由于抗菌药物在临床上的广泛应用,沙门氏菌耐药率呈上升趋势,已引起社会的普遍关注,迫切需要进行耐药机制的研究。为阐述抗菌药物压力下沙门氏菌的耐药变异规律和在动物体内生长能力的变化,本研究从mRNA水平、DNA水平和对动物致病力方面系统地研究了沙门氏菌在6种抗菌药物(阿莫西林、阿米卡星、氟苯尼考、头孢噻呋、多西环素和恩诺沙星)的压力下,主要耐药相关基因在诱导后菌株间的变异规律,及基因突变菌株对动物致病力的变化。
1.沙门氏菌耐药株的体外人工诱导
对实验室保存的2株猪源沙门氏菌SY23、SGX7和2株鸡源性沙门氏菌SDMP6、SJX9进行血清型鉴定,结果表明,SY23、SGX7为猪霍乱沙门氏菌,SDMP6、SJX9为鸡白痢沙门氏菌。通过药物浓度递增法对此4株沙门氏菌进行了体外耐药诱导,结果显示猪霍乱沙门氏菌SY23和SGX7较鸡白痢沙门氏菌SDMP6和SJX9产生耐药性更快。采用E-Test纸片法测定诱导前后菌株对5种抗菌药物的敏感性,结果显示诱导后菌株对其他药物较易产生交叉耐药性;同时发现存在诱导后菌株敏感性升高的现象,表明体外持续抗生素压力下沙门氏菌耐药性变化的不定向性。同时进行了诱导前后菌株体外生长能力的比较分析,结果显示SJX9的诱导后菌株比诱导前生长繁殖均明显加快;SGX7诱导后菌株与诱导前生长繁殖快慢相比,变化不一致;以SDMP6诱导后菌株多数生长速率明显加快;以SY23诱导后菌株生长繁殖能力变化不一致,但至平台期时,其OD600与诱导前菌株接近。
2.沙门氏菌主要多重耐药相关基因mRNA水平差异
采用荧光定量PCR方法对4株沙门氏菌药物诱导后菌株与亲本株的4种主要外排泵相关基因(acrA、acrB、tolC和ramA)的mRNA表达水平进行比较。结果显示:6种药物诱导后菌株acrA、acrB、tolC的mRNA表达水平和ramA的升高程度相关性较小,ramA的高度表达并没有引起acrA和acrB的高度表达;氟苯尼考诱导菌株acrA、acrB、tolC的基因表达水平与药敏结果存在相关性,其他药物诱导菌株各基因表达水平与药敏结果相关性存在较大差异。
3.沙门氏菌ramA—ramR、gyrA和parC基因序列分析
对诱导前后的代表性菌株进行ramA—ramR基因测序及序列比对分析。结果显示,诱导亲本株的ramA基因均未发生任何突变,但亲本株SY23、SGX7启动区171位发生点突变G→T,ramR基因发生T83M(ACG→ATG)取代,同时,SGX7启动区还发生了278位点突变C→T;18株药物诱导菌株中有6株ramA基因发生突变;除F—7—9外其余17株诱导后菌株启动区均存在171位点突变G→T;ramR基因序列分析除F—7—9发生M84T(ATG→ACG)及G180R(GGA→AGA)取代外,其余17株诱导菌株均存在T83M(ACG→ATG)取代,且发现SGX7的恩诺沙星诱导株E—16—7和头孢噻呋诱导株头—10-7的ramR基因的开放阅读框内存在IS1序列插入。
对4株沙门氏菌亲本株及其恩诺沙星诱导株进行gyrA和parC基因测序分析,发现亲本株gyrA基因均存在突变,SY23,SGX7,SJX9菌株发生了S83F取代,SDMP6发生了D87Y取代,parC基因均未发生任何突变。SY23的诱导株E—14—3的两基因均存在单突变,gyrA发生S83F取代,parC发生S80R;E—16—3的两基因均存在双突变,gyrA发生S83F和D87Y取代,parC发生S80R和E84G取代;E—14—3和E—16—3对恩诺沙星的MIC菌大于256μg/mL,可见菌株的氟喹诺酮类药物高度耐药表型往往是gyrA与parC基因双突变造成的。其余沙门氏菌的诱导株与诱导前比较没有变化,对恩诺沙星的MIC变化也不大。
4.沙门氏菌人工诱导耐药突变株在小鼠体内适应性的研究
通过小鼠体内竞争性生长试验研究沙门氏菌人工诱导耐药突变株和亲本株在小鼠体内适应性的差别。结果表明SGX7的恩诺沙星诱导突变菌E—16—7、氟苯尼考诱导突变菌F—7—7的致病力下降,菌落生长较小;SY23的恩诺沙星诱导突变菌E—14—3和E—16—3的致病力升高,菌落生长大小与原菌基本相同;肝脏和脾脏中各菌的生长速率存在较好的一致性。结果提示沙门氏菌产生耐药突变后不一定导致致病力和适应性的降低,氟喹诺酮类药物高水平耐药可能提高沙门氏菌在小鼠体内的适应性。