目的:口腔种植现今已成为重要的口腔修复方式,其中钛及钛合金是目前最常用的口腔种植材料。然而在其应用过程中,种植失败时有发生,这与人体复杂的体液环境有关。前期研究发现,金属铌作为一种耐蚀性良好的生物材料,在耐口腔氟离子腐蚀方面弥补了钛及钛合金的不足。种植体植入之后,组织愈合过程产生炎症反应,炎症过程产生的氧化应激环境,可能加速金属腐蚀,金属的腐蚀产物会对周围细胞产生一系列毒性作用。所以金属生物材料在应用前,有必要评价其在氧化应激条件下的细胞毒性。本实验目的是以金属钛和聚苯乙烯为对照,研究金属铌在双氧水诱导的氧化应激条件下对Ea.hy926细胞的毒性作用。为金属铌作为一种新的口腔种植材料提供依据。方法:1.细胞培养EA.hy926人脐静脉内皮细胞株购于上海中科院细胞库,培养于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,培养条件为37℃（5%CO₂）环境。所有实验均使用24孔板,每种材料表面接种1mL细胞,细胞密度为50,000/mL。培养两天后,改用含不同浓度双氧水的无酚红高糖DMEM培养基继续培养1或24小时。2.细胞氧化应激模型建立实验使用24孔板,每种材料表面接种1mL细胞,细胞密度为50,000/mL。培养两天之后,通过光镜观察细胞汇合度达到80%。改为含0,0.1,0.2,0.5mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液培养24小时。CCK-8法检测细胞活力。3.金属材料制备实验采用直径为15mm,厚度为2mm金属铌片和金属钛片。金属表面打磨抛光至平均粗糙度小于20nm.使用前用1%曲拉通,无水丙酮,无水乙醇超声各20分钟,高温高压灭菌。4.细胞毒性检测使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。经过两天培养后,改用含0,0.1,0.2 mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液继续培养24小时。CCK-8法检测细胞活力。5.细胞凋亡检测使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。经过两天培养后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液继续培养24小时。收集细胞,分别加入FITC标记的Annexin V和PI染色,应用流式细胞仪来检测各组凋亡率。6.细胞骨架染色使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。经过两天培养后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液继续培养24小时。各组材料表面培养的细胞使用4%多聚甲醛固定15分钟,使用1%曲拉通,透膜5分钟,PBS洗三次后,用鬼笔环肽在避光条件下染色15分钟,使用DAPI细胞核染色5分钟。在暗室使用荧光显微镜观察各组细胞形态。7.细胞内活性氧检测通过给各组细胞预先载入DCDHF-DA荧光探针,荧光酶标仪检测细胞内活性氧水平。使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。用10umol/L DCDHF-DA溶液孵育30分钟,无血清DMEM培养基清洗三次后加入含0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液培养1小时。使用荧光酶标仪在激发光488nm,发射光525nm的条件下检测荧光强度。8.还原型谷胱甘肽检测使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。经过两天培养后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液培养24小时。分别收集各孔细胞,PBS洗两次,细胞经超声匀浆裂解,4℃条件下高速离心机12,000g离心15分钟。收集离心后的上清液,使用BCA法检测蛋白浓度,按照试剂盒的说明检测细胞内还原型谷胱甘肽总量。9.超氧化物歧化酶检测使用24孔板,细胞接种于不同材料表面,方法如上。经过两天培养后,改用含0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂的无酚红DMEM培养液培养24小时。分别收集各孔细胞,PBS洗两次,细胞经超声匀浆裂解,4℃条件下高速离心机12,000g离心15分钟。收集离心后的上清液,使用BCA法检测蛋白浓度,按照试剂盒的说明检测细胞内超氧化物歧化酶活力。结果:1.氧化应激模型建立随着双氧水浓度的升高,细胞活力降低。将0mmol/L H₂O₂组细胞活力设为100%,0.1mmol/L H₂O₂组细胞活力并未明显下降,0.2mmol/L H₂O₂组细胞活力接近0mmol/L H₂O₂组细胞活力50%,达到半数抑制浓度IC50,而0.5mmol/L H₂O₂组细胞活力仅为0mmol/L H₂O₂组细胞活力的0.9%。所以我们选择浓度为0,0.1,0.2mmol/L H₂O₂进行后续实验。2.细胞毒性检测CCK-8法检测在相同双氧水浓度条件下,金属铌、钛及聚苯乙烯材料对Ea.hy926细胞的毒性作用,结果没有统计学差异（p>0.05）。各组材料在0.1mmol/L H₂O₂条件下,细胞活力并未明显下降,0.2mmol/L H₂O₂组细胞活力接近0mmol/L H₂O₂组细胞活力一半。3.细胞凋亡检测流式细胞仪细胞凋亡检测显示,各组材料表面培养细胞其凋亡率均随双氧水浓度升高而提高,在相同双氧水浓度下,三种材料之间细胞凋亡率无统计学差异（p>0.05）。4.细胞骨架染色各组材料表面培养细胞在0mmol/L H₂O₂条件下均铺展良好,细胞在0.1mmol/L H₂O₂条件下仍保持了良好的伸展形态,而0.2mmol/L H₂O₂条件下,部分细胞变圆甚至从材料表面分离。三种材料表面培养的细胞,在相同双氧水浓度条件下,细胞形态无明显差异。5.细胞内活性氧检测在相同双氧水浓度条件下,接种在不同材料表面的细胞,其细胞内活性氧强度无明显差异（p>0.05）。相比0mmol/L H₂O₂组,0.1mmol/L H₂O₂组细胞内活性氧强度无明显增强,而0.2mmol/L H₂O₂组细胞内活性氧强度几乎是0mmol/L H₂O₂组两倍。6.细胞内还原型谷胱甘肽检测在相同双氧水浓度条件下,接种在不同材料表面的细胞,其细胞内还原型谷胱甘肽水平无明显差异（p>0.05）。细胞内还原型谷胱甘肽水平均随双氧水浓度升高而逐渐降低。7.细胞内总超氧化物歧化酶活力检测在相同双氧水浓度条件下,接种在不同材料表面细胞,其细胞内总超氧化物歧化酶活力无明显差异（p>0.05）。细胞内总超氧化物歧化酶活力随双氧水浓度升高而逐渐降低。结论:与金属钛和聚苯乙烯相比,金属铌在氧化应激条件下未对其表面培养Ea.hy926细胞产生的毒性作用。说明金属铌在氧化应激条件下,具有良好的生物相容性。