骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种由多种危险因素,包括遗传和表观遗传、种族、年龄、性别、肥胖和炎症等引起的退行性骨关节病。其特点是软骨破裂、软骨下骨硬化、骨刺、关节畸形和滑膜炎症。65岁以上的老年人经X线检查确诊的OA患者约为80%。OA通常导致关节疼痛、僵硬、运动障碍和功能丧失。由于OA的危险因素很多,且始动因素尚不清楚,因此OA的发病机制尚不清楚。但OA直接表现为关节软骨的退变和磨损,所以软骨细胞的代谢成为了研究热点,尤其是调节软骨代谢的分子机制。细胞粘附分子1（Cell adhesion molecule 1,CADM1,又称RA175/Syn CAM1/TSLC1/Necl-2/IGSF4）是免疫球蛋白超家族（Ig SF）的成员之一,在多种肿瘤相关研究中被作为抑癌基因而研究。目前对CADM1的研究范围越来越广泛,包括神经系统疾病、对骨代谢的影响等。CADM1除了抑制多数细胞增殖与转移、促进细胞的凋亡外,还与多种细胞信号传导通路相关。我们通过生物信息技术研究发现CADM1在OA软骨中表达增高,但其在OA发生和发展机制中的功能与作用尚未见报道。在OA中,PI3K/Akt/mTOR信号通路被磷酸化激活,从而抑制自噬引起软骨细胞合成、分解失衡,促进OA的进展。因此,本实验对CADM1在OA的发生与进展中所起的作用及相关分子机制进行研究。一、CADM1在骨关节炎软骨组织中的表达情况通过生物信息技术对Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（GSE113825）进行基因数据分析,可知CADM1在OA软骨组织中表达明显升高。同时,我们对正常软骨与OA软骨进行基因表达检测,q RT-PCR结果显示,OA软骨中CADM1的m RNA表达水平明显升高;蛋白免疫印迹（Western blotting,Wb）结果显示:OA软骨中CADM1的蛋白表达水平同样明显升高;免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）结果与前述结果一致。这些实验结果表明,在OA软骨组织中,CADM1基因与蛋白的表达水平均明显增高。二、CADM1在IL-1β诱导的人原代软骨细胞体外骨关节炎模型中的表达情况,以及敲低CADM1对人原代软骨细胞合成、分解代谢及自噬的影响我们使用提取的人原代软骨细胞构建OA的体外模型,来研究CADM1在OA中的表达以及功能。通过q RT-PCR与Wb技术检测,我们发现CADM1在体外OA模型软骨细胞中基因及蛋白的表达水平均明显升高。与第一部分中CADM1在OA患者的软骨组织中表达升高相一致,这表明CADM1可能在OA的发生与发展中起到某种作用。为了进一步验证CADM1是否影响OA软骨细胞代谢功能,我们通过小干扰RNA技术,对IL-1β处理的人原代软骨细胞进行CADM1基因敲低。通过番红“O”染色技术对糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs）沉积进行检测,结果显示,敲低CADM1明显增加细胞外基质中GAGs的沉积;Wb结果显示:敲低CADM1明显增加软骨细胞合成代谢指标（Collagen II and Aggrecan）的蛋白表达水平,同时分解代谢指标（ADAMTS-5 and MMP-13）蛋白表达水平明显下降。这表明,敲低CADM1可促进OA体外模型中软骨细胞的合成代谢,同时抑制其分解代谢,从而增加细胞外基质的含量。为了了解CADM1在软骨细胞中与自噬之间的关系,我们使用Wb检测自噬标志物的蛋白表达以及使用电子显微镜观察自噬小体和自噬溶酶体的数量。结果显示:敲低CADM1使自噬标志物P62蛋白表达水平明显降低,Beciln-1蛋白表达水平与LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显增加,同时使自噬小体和自噬溶酶体的数量明显增多。这表明,敲低CADM1促进自噬作用。为了了解敲低CADM1是否通过激活自噬影响软骨细胞的代谢,我们使用自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）进行回复验证,结果显示:CQ可以阻断敲低CADM1促进软骨细胞的合成、抑制其分解以及增加GAGs沉积的作用。这一结果表明,敲低CADM1是通过激活自噬来发挥促进软骨细胞合成代谢、抑制其分解代谢作用的。三、敲低CADM1在由IL-1β诱导的人原代软骨细胞体外骨关节炎模型中通过调控PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬,从而影响软骨细胞的代谢为了进一步探索敲低CADM1对自噬的调节机制,我们检测了与OA及自噬密切相关的PI3K/Akt/mTOR信号通路。通过Wb及免疫荧光技术,我们发现敲低CADM1使OA软骨细胞中PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平显著降低。这表明,敲低CADM1能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路。为了进一步探索敲低CADM1与PI3K/Akt/mTOR信号通路、自噬之间的关系,我们使用PI3K通路激活剂740Y-P进行回复实验,并再次使用了Wb检测自噬标志物的蛋白表达以及电子显微镜观察自噬小体和自噬溶酶体的数量。实验结果显示:740Y-P逆转了敲低CADM1对自噬的激活,使得自噬标志物Beclin-1蛋白表达和LC3II/I的比值显著下降、P62则升高,自噬小体和自噬溶酶体的数量减少。这表明:敲低CADM1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调节自噬,从而影响软骨细胞的代谢。四、敲低CADM1对由半月板失稳（DMM）引起的小鼠骨关节炎模型的影响前三部分实验表明,敲低CADM1通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,进而激活自噬,发挥促进OA软骨细胞合成代谢、抑制其分解代谢的作用。为了验证CADM1在动物体内发挥作用的情况,我们建立了DMM小鼠膝关节OA模型,并通过向关节内注射Si-CADM1下调软骨组织中CADM1的表达。然后通过免疫组化对相关指标进行检测以及番红“O”-固绿染色技术对小鼠关节进行OARSI评分。实验结果显示:敲低CADM1可明显增加Collagen II的表达,减少mTOR以及自噬标志物P62的表达,同时OARSI评分显示,敲低CADM1可明显抑制小鼠关节软骨的退变。综合以上实验,我们首先确立了以CADM1为研究靶标,并在体内、外研究了CADM1在OA中的功能及其相关分子机制。实验结果表明:敲低CADM1通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬,进而促进OA软骨细胞合成代谢、抑制其分解代谢。这为OA的发病机制提供了新的思路,同时为OA的治疗提供了新的方向。