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平头炭疽菌((Colletotrichum truncatum)引起的大豆炭疽病是影响大豆生长的重要病害,每年对我国的大豆生产造成严重损失。黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)和大丽轮枝菌(V.dahiiae)能够危害苜蓿、棉花等多种作物,是我国重要的检疫性病原真菌。为提高对平头炭疽菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的早期快速诊断技术水平,在病菌侵染初期准确诊断出病原菌的存在,降低经济损失,本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),分别建立了 以下三种可特异性检测平头炭疽菌、黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的LAMP技术体系。第一章的研究基于环介导等温扩增技术(LAMP),以Rpb1(the large subunit of RNAolpymerase Ⅱ,RNA聚合酶Ⅱ大亚基)为靶标基因,建立了平头炭疽菌的LAMP检测体系。反应条件为62℃ 60min,反应结束后在反应管内加入SYBR Green Ⅰ可直接判定结果,阳性反应呈黄绿色,阴性反应为橙色。该体系检测的灵敏度为100pg·μL-1。该技术体系可以直接对田间发病组织中的病原菌进行检测,应用该技术我们成功且快速地对江苏、安徽和湖北采集的发病大豆样本和来自不同地区的大豆种子进行了病害诊断和病原菌的检测。第二章的研究基于环介导等温扩增技术(LAMP),以Tub(β-tublin,β-微管蛋白)作为靶标基因,建立了检测黑白轮枝菌的LAMP体系。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后可直接通过肉眼观察颜色变化判定结果,阳性反应呈天蓝色,阴性反应为紫色。该方法的最低检测限为1pg·μL-1,在土壤中的检测灵敏度为10个孢子/0.25g 土壤,在苜蓿种子中检测的灵敏度为50个孢子/10g种子。应用该技术在采自新疆的7份苜蓿黄萎病疑似样本中检测到3份阳性。该方法的建立为黑白轮枝菌的检验检疫及其所致病害的诊断提供了新的技术。第三章的研究基于环介导等温扩增技术(LAMP),以Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法。该方法在62℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据颜色变化判定扩增结果,阳性为天蓝色,阴性为紫色。该方法的最低检测限为100 pg·μL-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25 g 土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。大豆根部病害是造成我国大豆生产中产量损失的主要因素。其病原菌种类复杂,病害症状相似,不易区别,给病害准确诊断带来困难。为了明确黄淮地区大豆根腐病病原种类及其致病优势种,本研究采用本实验室研发的分别针对尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)、木贼镰孢菌(F.equiseti)、层出镰孢菌(F.proliferatum)、黄色镰孢菌(F.culmorum)、禾谷镰孢菌(F.graminearum)、茄腐镰孢菌(F.solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆炭腐病菌(Macrophomina phaseolina)、冬青丽赤壳菌(Calonectria ilicicola)和大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)的10个LAMP检测体系对采自山东省、江苏省、安徽省的165份大豆根部病害样本进行检测。LAMP检测结果显示,上述10种病原菌的检出率依次分别为26%、28%、12%、18%、13%、16%、17%、8%、38%和44%;黄淮地区大豆根部病害由病原菌复合侵染引起是一种普遍现象,复合侵染病害样本比率占所检测阳性病害样本的75%,多数由2种或3种病原菌复合侵染引起。大豆疫霉菌和冬青丽赤壳菌为引起该地区大豆根腐病的优势种群。本研究应用10个大豆根部病原菌的LAMP检测体系对10种病原菌同时进行检测,灵敏度高、特异性强,反应迅速、操作简便,适用于大豆根部病原菌的快速检测及其所致病害的快速诊断。