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研究背景骨髓异常增生综合征（myelodysplastic syndromes,MDS）是一组起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,特点为无效造血、血细胞减少,高危MDS会向急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）转化。基因组高度甲基化是MDS的一个重要特征,基因甲基化程度也明显影响MDS患者预后,因此MDS被认为是一种表观遗传疾病。根据国际预后评分系统（International Prognostic Scoring System,IPSS）和修订版国际预后评分系统（IPSS-R）可以将MDS分为较低危组（lower risk,LR）和较高危组（higher risk,HR）。美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南推荐HR-MDS患者采去甲基化药物（hypomethylatingagents,HMA）作为一线治疗,其中最常用的药物包括地西他滨（decitabine,DAC）。DAC单药治疗MDS患者的总反应率约33%-55.4%,疗效持续时间只有6-24个月。有研究将HMA与靶向药物（如BCL-2抑制剂、TP53突变调节剂APR-246、CD47单克隆抗体IBI188等）联合应用于MDS患者,初步研究结果显示联合治疗可以提高疗效、延长生存。“HMA+X”的治疗策略有望使MDS患者获益,因此需要更多来自基础和临床的深入探索。全反式维甲酸（all-trans retinoicacid,ATRA）是维生素A的一种活性代谢产物,在细胞分化、增殖、凋亡和胚胎发育中发挥关键作用。ATRA广泛应用于急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia,APL）患者,通过靶向PML-RARα融合蛋白,促进APL患者的早幼粒细胞向终末阶段分化,将APL从高度致死性疾病转变为高度可治愈性疾病。鉴于ATRA在APL患者中的成功应用,国内外研究人员开展了一系列基础和临床研究,拓展ATRA在非APL的髓系恶性肿瘤中的作用价值。根据Schlenk等发表在Leukemia的研究报道,ICE（伊达比星,阿糖胞苷和依托泊苷）方案的基础上联合ATRA可以提高老年AML患者的完全缓解率（complete remission rate,CRR）,延长无事件生存期（event-free survival,EFS）和总生存期（overall survival,OS）。一项临床研究显示,联合使用DAC和ATRA可以使MDS患者和不适合进行强化疗的老年AML患者获益。除此之外,有研究将DAC和ATRA以单药或联合的形式分别作用于AML细胞系中,发现体外联合用药可以协同促进细胞凋亡并抑制细胞增殖。然而,DAC和ATRA发挥协同作用背后的分子机制仍不清楚。研究目的明确DAC联合ATRA对MDS细胞活力和凋亡水平的影响,并探索联合用药协同增强细胞杀伤作用的具体分子机制。在动物模型上分析小鼠肿瘤负荷和生存时间,进一步验证两药的协同作用。开展地西他滨联合维A酸片治疗MDS-原始细胞增多型（excess blast,EB）患者的前瞻性、多中心、随机对照、Ⅲ期临床试验,通过分析临床试验中期单中心患者各项临床资料,比较DAC联合ATRA治疗MDS-EB的安全性和有效性。研究方法（1）体外实验以MDS细胞株MDS-L和MDS转白血病细胞株MOLM-13为主要研究对象,研究DAC联合ATRA对MDS细胞活力和凋亡水平的作用。利用MTS法通过酶标仪检测细胞活力,通过Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平;通过流式细胞术检测凋亡细胞比例和线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxidasespecies,mitoROS）水平;通过免疫荧光、共聚焦显微成像、Western blot和q-PCR 检测核因子 E2 相关因子 2（Nuclearfactor E2relatedfactor2,Nrf2）通路活化情况;利用慢病毒转染构建维甲酸受体α（retinoic acid receptor α,RARα）shRNA的细胞株,并利用Western blot和q-PCR确定RARα敲低是否成功;通过免疫共沉淀技术验证Nrf2和RARα的关系。（2）体内实验以 NOD-PrkdcscidIL2rgtm1/Bcgen（B-NDG）小鼠为研究对象,通过尾静脉注射MOLM-13-luciferase细胞构建异种移植小鼠模型。将构建成功的小鼠随机分为四组,分别给予安慰剂、DAC、ATRA、DAC联合ATRA进行治疗。定期通过荧光成像仪检测肿瘤负荷。待小鼠双下肢瘫痪时处死,记录并比较不同处理组的生存时间。通过苏木素-伊红（Hematoxylinand Eosin,HE）染色检测小鼠脾脏中MOLM-13-luciferase细胞浸润情况。（3）通过分析单中心接受DAC单药方案和DAC联合ATRA方案两组患者的临床资料,评估治疗反应和不良反应,比较组间疗效和不良反应的差异。研究结果（1）DAC联合ATRA协同抑制细胞活力并促进细胞凋亡与各自单药相比,联合治疗可以显著抑制MDS-L和MOLM-13细胞系以及MDS和AML患者原代细胞的活力。除此之外,DAC联合ATRA提高了 MDS-L和MOLM-13的Cleaved Caspase 3和Cleaved PARP表达水平,表明两药联合显著增强了细凋亡水平。通过MOLM-13-luciferase的异种移植小鼠模型发现,DAC联合ATRA显著降低小鼠体内肿瘤负荷,延长小鼠生存时间,并减轻小鼠脾脏的恶性细胞浸润。（2）DAC单药通过活化Nrf2抗氧化通路引起DAC耐药DAC单药处理使细胞浆中Nrf2入核活化,促进下游基因NQO1和DUSP1等转录激活,通过抑制mitoROS水平等途径导致DAC耐药。（3）DAC联合ATRA通过抑制Nrf2活化提高凋亡水平从而逆转耐药DAC联合ATRA处理后,Nrf2下游抗氧化基因表达下调,引起胞内mitoROS水平升高,从而提高细胞凋亡比例。N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）预处理可以通过清除ROS逆转药物引起的凋亡,表明凋亡依赖于mitoROS的产生。（4）ATRA通过活化RARα-Nrf2复合体抑制Nrf2通路不论是DAC单药还是DAC联合ATRA处理的细胞中均存在RARα-Nrf2复合体。不同的是,DAC联合ATRA处理MDS细胞中,复合体结合的HDAC1减少,表明RARα-Nrf2复合体被ATRA激活,由此抑制Nrf2通路活化。（5）DAC和ATRA联合用药提高患者的总体反应率,同时未增加血液学不良反应高危MD S患者接受DAC和ATRA联合治疗后的总体反应率（overall response rate,ORR）为76.67%,显著高于单药组患者的55.17%（P=0.014）。单药和联合组患者的血液学不良反应的发生率没有差异（P＞0.05）。结果表明联合用药提高患者疗效的同时并未增加血液学不良反应。比较两组患者的非血液不良反应,包括发热、肺炎、ALT升高、AST升高、TBil升高、Cr升高、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、恶心、腹泻、腹痛、头痛、皮肤干燥、骨痛、斑丘疹、唇炎、口腔粘膜炎,发现联合组头痛的不良反应发生率显著高于对照组（P=0.042）,其余不良反应发生率均没有统计学差异（P＞0.05）。研究结论本课题首先通过体外和体内实验证实DAC联合ATRA在MDS中具有协同抑制细胞活力和促进凋亡的作用。继而,我们对协同效应背后的分子机制进行了深入探究,发现RARα-Nrf2复合体在地西他滨耐药中发挥重要作用,使用ATRA活化该复合体可以抑制Nrf2通路,提高细胞内氧化应激水平,从而增强ROS依赖的凋亡,达到逆转耐药的目的。临床试验中期结果表明:DAC和ATRA联合用药显著提高总体反应率的同时并未增加血液学不良反应。靶向Nrf2信号通路的治疗与标准去甲基化治疗的结合具有进一步研究的潜力,将为高危MD S的治疗带来新希望。